CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.8. Phương pháp phân tích phổ IR
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 2.1). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, cịn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này.
Bảng 2.1. Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan trên phổ hồng ngoại [57]
Đỉnh Dao động
775 Dao động dãn vòng của - anome
802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6 822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí
845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của - anome
893 Dao động của liên kết C1-H của - anomer 917 Dao động vòng của -anome
1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal 1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O
1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO 1430 Dao dộng gấp của C-H
1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H
Mẫu glycosaminoglycan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga), trong vùng số sóng 4000-400 cm-1 [55]. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm- 1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [55, 58, 59].
2.3.9. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi
monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết glycosaminoglycan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học từ 5,0 đến 5,5 ppm là vùng của H-1 (H- α) của glycosaminoglycan.
Hình 2.4. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide
Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của glycosaminoglycan do các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H- NMR. Vì vùng giá trị lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C- NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với glycosaminoglycan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vịng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện trong
vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm (hình 2.4). Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín hiệu của các ngun tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm.
Như vậy, có thể thấy việc đánh giá và phân tích cấu trúc của các polysaccharide là rất khó khăn và với glycosaminoglycan cịn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại khơng cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H- NMR và 13C-NMR là không đủ. Để đánh giá phân tích cấu trúc các polysaccharide phức tạp này, các nhà nghiên cứu thường kết hợp các phương pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc.