hải sâm Holothuria atra
Phân tích xác định thành phần của các monosaccharide là việc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharite nói chung và của glycosaminoglycan nói riêng. Glycosaminoglycan là một polymer dị thể có thành phần hóa học phức tạp, PS từ hải sâm được phân chia thành hai nhóm khác nhau là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS), chúng còn chứa các đường đơn khác như galactose, mannose, xylose, glucose,... và uronic axít. Vì vậy, để xác định thành phần hóa học của glycosaminoglycan chúng tôi tiến hành thủy phân glycosaminoglycan thành các monomer trong môi trường axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đường đơn của glycosaminoglycan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đường đơn trong mẫu glycosaminoglycan. Sắc ký đồ GLC và thông số của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.3 và bảng 3.3, sắc ký đồ của phân đoạn F2 trên hình 3.4.
Hình 3.3. Sắc ký đồGC của các mẫu đường đơn chuẩn
Bảng 3.3. Thông sốcác mẫu đường đơn chuẩn được đo bằng phương phápsắc kí khí GC
Hình 3.4. Sắc ký đồGC của thành phần đường đơn phân đoạn F2
Kết quả phân tích thành phần hóa học của phân đoạn F1 và F2 (bảng 3.4) cho thấy, phân đoạn F1 có chứa đồng thời cả 3 gốc đường là Fucose (Fuc), N- Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic axit (GlcA) với các tỉ lệ khác nhau là (Fuc) : (GlcA) : (GalNAc) = 1 : 0,86 : 1,03, phân đoạn F2 chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc), so với mẫu GAG ban đầu (bảng 3.2), (Fuc) : (GlcA) : (GalNAc): (Gal) = 1 : 0,95 : 1,13 : 0,16, nhận thấy sau khi tách phân đoạn mẫu GAG ban đầu cho ra hai phân đoạn F1 và F2 có sự khác biệt rõ rệt về thành phần các gốc đường trong mỗi phân đoạn. Kết quả xác định một số thành phần hóa học của phân đoạn F1 và F2 (bảng 3.4) so với mẫu GAG ban đầu (bảng 3.2) cũng cho thấy một số khác biệt phân đoạn F1 có hàm lượng sulfate cao hơn (24,5%) so với mẫu GAG (23,2%) nhưng thấp hơn phân đoạn F2 (28,6%), kết quả này có thể được giải thích là do trong quá trình tách phân đoạn bằng sắc ký trao đổi anion các phân đoạn được rửa giả theo gradient tăng dần nồng độ của dung dịch rửa giải (muối NaCl), do vậy phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm nhỏ hơn (NaSO3-) liên kết với pha tĩnh yếu hơn sẽ được rửa giải ra
sớm hơn và phân đoạn nào có mật độ nhóm mang điện tích âm (NaSO3-) lớn hơn được rửa giải ra muộn hơn. Uronic axit chỉ được phát hiện thấy trong phân đoạn F1 với hàm lượng là 5,2%, nhưng không phát hiện thấy
có mặt trong phân đoạn F2, ngoài nhóm uronic axit không phát hiện thấy trong phân đoạn F2 thì protein cũng không được phát hiện thấy trong cả hai phân đoạn F1 và F2. Hàm lượng tổng carbohydrate của phân đoạn F1 (46,2%) cao hơn so với mẫu GAG ban đầu (43,5%), nhưng thấp hơn so với phân đoạn F2 (49,1%), sự khác nhau về hàm lượng tổng carbohydrate giữa hai phân đoạn và mẫu GAG ban đầu là do trong mẫu GAG ban đâu và phân đoạn F1 có chứa nhiều thành phần khác hơn so với phân đoạn F2 (như uronic axit, protein,..) . Theo các nghiên cứu trước đây về glycosaminoglycan hải sâm [3, 8, 18] phân đoạn F1 với thành phần monosaccharide gồm fucose, N-Acetyl-galactosamin, glucuronic axit và sulfate được xếp vào nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS) , trong khi đó phân đoạn F2 được xếp vào nhóm fucan sulfate (FS) vì chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc) và sulfate. Công trình nghiên cứu của Phạm Đức Thịnh và các cộng sự về hải sâm Stichopus variegatus [49], mẫu GAG của hải sâm S.
variegatus sau khi chiết tách phân đoạn nhận được ba phân đoạn F1, F2, F3 với
các kết quả trong (bảng 3.5), phân đoạn F1 có chứa năm gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic axit (GlcA), Galactose (Gla), Glucose (Glu), trong đó Galactose (Gla), Glucose (Glu) chỉ chiếm lượng rất thấp, hàm lượng sulfate (33,24%); phân đoạn F2 có chứa ba gốc đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic axit (GlcA), hàm lượng sulfate (35,18%); phân đoạn F3 chỉ chứa duy nhất một gốc đường Fucose (Fuc), hàm lượng sulfate (38,60%), và đã được chứng minh F1 và F2 thuộc nhóm fucosylated chondroitin sulfate (FCS), F3 thuộc nhóm fucan sulfate (FS). Kết quả trong (bảng 3.4) cũng cho thấy sự tương đồng so với kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của các phân đoạn từ các loài hải sâm khác trên thế giới [4; 1; 7; 8; 18].
Từ tất cả các dẫn chứng trên, nhận thấy fucose là thành phần được phát hiện có mặt trong tất cả các phân đoạn của các loài hải sâm, tuy nhiên hàm
lượng của gốc đường này trong các phân đoạn của mỗi loài là khác nhau và thậm chí là trong cùng một loài cũng không giống nhau. Ngoài 3 gốc đường chính là Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc), Glucuronic axit (GlcA), các gốc đường Galactose (Gla) và Glucose (Glu) cũng được phát hiện với hàm lượng rất nhỏ trong một số phân đoạn. Bên cạnh các gốc đường đơn, sulfate cũng được phát hiện có mặt trong tất cả các loài hải sâm, mỗi phân đoạn lại có hàm lượng khác nhau, và trong cùng một loài thì hàm lượng sulfate của các phân đoạn có sự thay đổi tuyến tính tăng dần theo nồng độ rửa giải của muối NaCl. Sự biến đổi về hàm lượng sulfate của các phân đoạn trong cùng một mẫu khi tách phân đoạn có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate trong phân tử của mỗi phân đoạn càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Sepharose Fast Flow càng mạnh, nên để giải phóng phân đoạn GAG này cần dung dịch có nồng độ muối cao hơn, vì thế phân đoạn được rửa giải ở nồng độ muối càng cao thì sẽ cho ra hàm lượng sulfate càng cao. Vì vậy, ta thấy các phân đoạn rửa giải ở nồng độ muối cao hơn có hàm lượng sulfate lớn hơn các phân đoạn được rửa giải ở nồng độ muối thấp hơn. Ngoài ra, hàm lượng uronic acid được chứng minh có mặt trong tất cả các phân đoạn dạng FCS [22].
Bảng 3.4. Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
GAG Tổng Tỷ lệ mol giữa các gốc Sulfate Uronic Protein
carbohydrat đường **% acid **%
% **%
Fuc GlcA GalNAc Gal
F1 46,2 1 0,86 1,03 - 24,5 5,2 -
F2 49,1 1 - - - 28,6 - -
Bảng 3.5.Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Stichopus variegatus [49]
GAG Tỷ lệ mol giữa các gốc đường Sulfate Protein
**% **%
Fuc GlcA GalNAc Gal Glc
F1 0,54 0,39 1 0,09 0,02 33,24 3,22
F2 0,26 0,45 1 - - 35,18 2,05
F3 1 - - - - 38,60 0
**% tính theo khối lượng của mẫu GAG
Kết quả tách phân đoạn bằng sắc kí trao đổi anion trên cột DEAE- Sepharose fast flow, cũng như thành phần hóa học của phân đoạn F1 và F2 từ hải sâm Holothuria atra đã khẳng định thêm một lần nữa là glycosaminoglycan của hải sâm gồm hai nhóm cấu trúc là FS và FCS như các nghiên cứu đã được công bố trước đó [4; 1; 7; 8; 18]. Các phân đoạn FS và FCS của mỗi loài hải sâm đều không giống nhau ít nhất là về mặt thành phần hóa học (như tỷ lệ các gốc đường đơn, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic acid) . Kết quả này chỉ ra sự phức tạp về cấu trúc của GAG hải sâm. Vì thế, để sử dụng một cách hiệu quả vào từng mục đích khác nhau của xã hội thì việc nghiên cứu chi tiết đặc điểm cấu trúc của chúng là hết sức cần thiết.
3.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN HẢI SÂM
HOLOTHURIA ATRA
3.3.1. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F1 được chiết tách từ glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra
3.3.1.1. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F1
F1 cũng như sự phân bố của nhóm sulfate trong các gốc đường của phân đoạn này đã được thực hiện thông qua việc ghi và phân tích phổ IR. Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại của phân đoạn F1 (hình 3.5), cho thấy trên phổ này xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng tại các vùng số sóng 3446,44 cm-1 là của nhóm O-H , và tại 2924,75 cm-1 là của nhóm C-H, tại 1047,82 là của nhóm C-
O [1, 65, 66, 67], ngoài ra còn xuất hiện đỉnh hấp thụ ở vùng dao động bất đối xứng có dải hấp thụ tại 1256,56 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este [1, 65, 66,67,68]. Dải hấp thụ ở 1648,73 cm-1 là vùng dao động bất đối xứng của nhóm C=O thuộc nhóm đường GalNAc và GlcA [68, 69]. Xuất hiện ở vùng dao động đối xứng (C-O-S) có dải hấp thụ lớn tại 855,11 cm-1 là vị trí C4 axial của vòng fucopyranose ( 4-O-sulfated Fuc hoặc 4-O-sulfated-
GalNAc) [1,68, 69] và 1 dải hấp thụ nhỏ hơn ở 588,97 cm-1 cho thấy nhóm sulfate trong cũng có một lượng nhỏ ở vị trí C2 và/hoặc C3 [1].
C-O-S
S=O C=O
Hình 3.5. PhổIR của phân đoạn F1
3.3.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của phân đoạn F1
Tương tự như phổ NMR của fucosylated chondroitin sulfate của các loài hải sâm khác trên thế giới đã được công bố [62, 66, 67]. Phổ 1H-NMR của phân
đoạn F1 cũng rất phức tạp với nhiều vùng tín hiệu khác nhau, đồng thời các tín hiệu có sự chồng lấn, trùng lặp nhau với độ phân giải rất kém kết quả này là do trong thành phần cấu tạo có chứa đồng thời nhiều gốc đường khác nhau, ngoài ra mỗi gốc đường lại có mức độ sulfate hóa lẫn kiểu liên kết O-glycoside khác nhau. Do vậy, rất khó để có thể giải thích được một cách chi tiết tất cả các tín hiệu trên phổ này. Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR (hình 3.6) của phân đoạn F1 cho ta thấy những vùng tín hiệu đặc trưng của fucosylated chondroitin sulfate, đó là các tín hiệu mạnh của proton H-6 thuộc nhóm metyl (–CH3) vòng fucose,
ở độ dịch chuyển hóa học 1,16-1,44 ppm [5, 6, 68]. Phát hiện thấy sự có mặt của nhóm acetyl vòng GalNAc (CH3CO-) ở vùng tín hiệu 2,08- 2,3ppm [1, 66], kết quả này một lần nữa xác nhận sự có mặt của các gốc đường fucose và N-Acetyl-galactosamin trong phân đoạn này. Các tín hiệu trong vùng độ dịch chuyển hóa học 5,67ppm cho ta nhận biết được gốc uronic acid, vùng tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 5,1-5,4 ppm đặc trung cho proton H1 của vòng
pyranose tương ứng với các gốc Fuc (2,4S) ở 5,42ppm; gốc Fuc (4S) ở 5,28ppm và gốc Fuc không có gốc sulfate ở 5,10ppm [1, 5, 66, 67], vùng tín hiệu 4,0 ta lại tiếp tục nhận được 2 nhóm vòng GlcA (H4) và GalNAc (H2)[1, 69] và vùng tín hiệu 4,26 là của nhóm vòng GalNAc (H6) [1, 67], vùng tín hiệu 3,63 – 3,77 ppm là vùng tín hiệu của vòng GlcA (H2, H3, H5 ) [1, 67], nhóm các tín hiệu trong vùng 5,1-5,42 ppm ở phổ 1H-NMR (hình 3.6) là các tín hiệu đặc trưng của proton anomeric (H1), trong vùng này xuất hiện 3 nhóm tín hiệu khác so cho thấy sự tồn tại của gốc đường fucose với các mức độ sulfate hóa khác nhau đó là các gốc O-2, 4-di-sulfate, O-3,4-di-sulfate ở 5,42ppm O-4-sulfate ở 5,23 ppm và gốc fucose không chứa nhóm sulfate ở 5,1 ppm.[5, 6, 66]
H1-anomeric G lc A -H 2, H 3, H 5 GalNAc-COCH3 H6-α-L-Fucp
Hình 3.6. Phổ1H-NMR của phân đoạn F1
3.3.1.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của phân đoạn F1
Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (hình 3.7) của phân đoạn F1 cho ta những vùng tín hiệu đực trưng của fucosylated chondroitin sulfate, đó là các tín hiệu mạnh của nhóm metyl (–CH3) vòng fucose ở độ dịch chuyển hóa học 16,47- 16,93 ppm trên phổ 13C-NMR [5, 6]. Phát hiện thấy sự có mặt của nhóm methyl GalNAc (CH3CO) tại vùng tín hiệu 23,5-23,8 ppm, nhóm uronic axit vòng GlcA tại vùng tín hiệu 100,99 ppm, kết quả lại một lần nữa cho thấy rằng phân đoạn F1 chứa cả ba gốc nhóm đường GalNAc, GalNAc, Fuc. Các nhóm tín hiệu trên phổ 13C-NMR (hình 3.7) nằm trong vùng 95-101 ppm đặc trưng cho carbon anomeric (C1) của vòng fucose, tương tự như phổ 1H-NMR (hình 3.6), trong vùng này cũng xuất hiện một số tín hiệu ở các độ dịch chuyển hóa học 95,03 ppm; 96,32 ppm; 97,32 ppm; 98,115 ppm và 99,68 ppm cho thầy sự có mặt của nhiều loại gốc đường đơn fucose với các mô hình sulfate khác nhau như: non- sulfate; 2-O-sulfate; 2,4-O-disulfate; 4-O-sulfate [5,14].
C1-GlcA 3 G al N A c- C O C H L -F uc p α - C 6-
Hình 3.7. Phổ13C-NMR của phân đoạn F1
3.3.2. Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F2 được chiết tách từ glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra
3.3.1.2. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F2
Kết quả phân tích quang phổ hồng ngoại của phân đoạn F2 (hình 3.8), cho thấy dải hấp thụ tại 3434,72 cm-1 là của nhóm O-H, xuất hiện ở vùng dao động bất đối xứng có dải hấp thụ tại 1257,79 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1648,08 cm-1 xác nhận sự có mặt của các axit uronic. Xuất hiện ở vùng dao động đối xứng (C-O-S) có dải hấp thụ lớn tại 846,72 cm-1 và 1 dải hấp thụ nhỏ hơn ở 581,13 cm-1 cho thấy nhóm sulfate trong phân đoạn F2 ở vị trí C4 của vòng fucopyranose và một lượng nhỏ ở vị trí C2 và/hoặc C3.
C-O-S
S=O
Hình 3.8. PhổIR của phân đoạn F2
3.3.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của phân đoạn F2
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (hình 3.9) của phân đoạn F2 cho ta những vùng tín hiệu đặc trưng của fulcan sulfate, đó là các tín hiệu mạnh của nhóm metyl (–CH3) vòng fucose ở độ dịch chuyển hóa học 1,16-1,40 ppm trên phổ [5, 6]. Ngoài ra không phát hiện thấy sự có mặt của nhóm methyl vòng GalNAc (CH3CO), kết quả lại một lần nữa cho thấy rằng phân đoạn F2 chỉ chứa duy nhất vòng fucose. Nhóm các tín hiệu trong vùng 5,0-5,4 ppm ở phổ 1H-NMR (hình 3.6) là các tín hiệu đặc trưng của proton anomeric (H1), trong vùng này xuất hiện 3 nhóm tín hiệu khác so cho thấy sự tồn tại của gốc đường fucose với các mức độ sulfate hóa khác nhau đó là các gốc O-2, 4-di- sulfate, O-3,4-di-sulfate ở 5,42 ppm O-4-sulfate ở 5,34 ppm và gốc fucose không chứa nhóm sulfate ở 5,07 ppm. Các tín hiệu proton này cũng tương tự như các tín hiệu của fucose được phân lập từ hải sâm L. grisea [3] và fucose được phân lập từ hải sâm P. graeffei và I. badionnotu [4, 6].
H6-α-L-Fucp
H1-anomeric
Hình 3.9. Phổ1H-NMR của phân đoạn F2
3.3.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của phân đoạn F2
Tương tự như phổ 13C-NMR của fucoidan rong nâu hay của fucan sulfate các loài hải sâm khác đã công bố [70, 48, 27], phổ của phân đoạn F2 (hình 3.10) cũng rất phức tạp với nhiều cụm tín hiệu chén lấn nhau với độ phân giải kém, do đó rất khó có thể giải thích chi tiết tất cả các tín hiệu trên phổ này. Tuy nhiên, trên phổ 13C-NMR của F2 cũng xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của fucan sulfate. Các nhóm tín trong vùng 95-101ppm (hình 3.10) đặc trưng cho cacbon anomeric (C1) của vòng fucose, tương tự như phổ 1H- NMR (hình 3.6) trong vùng này cũng xuất hiện một số tín hiệu ở các độ dịch chuyển hóa học 95,03 ppm; 96,30 ppm; 97,32ppm, 98,11ppm; và 99,68 ppm cho thấy sự có mặt của nhiều loại gốc đường fucose với các mô hình sulfate khác nhau như: non-sulfated; 2-O-sulfated; 2,4-O-disulfated; 4-O-sulfated. Tổ hợp các tín hiệu trong vùng độ dịch chuyển hóa học từ 16,47-16,93ppm đặc trưng cho nhóm cacbon C6 của nhóm methyl vòng fucose
C2-C5-α-L-Fucp C1-anomeric C 6- α- L -F u cp
Hình 3.10. Phổ13C-NMR của phân đoạn F2
Tóm lại: Bằng các phương pháp chiết tách và sắc kí trao đổi ion, hợp chất glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra đã được phân lập và phân tích một số dặc trưng cấu trúc. Hai phân đoạn glycosaminoglycan thu nhận được là F1- fucosylfated chondroitin sulfate và F2-fucan sulfate, cả hai phân đoạn này đều chứa hàm lượng sulfate cao lần lượt là 24,5% và 28,6% và nhóm sulfate chủ yếu nằm ở vị trí C4 của vòng pyranose. Trong phân đoạn fucan sulfate có đặc điểm cấu trúc rất đa dang với sự phân bố của nhóm sulfate ở nhiều vị trí khác nhau trong mỗi gốc fucose. Với đặc điểm cấu trúc