CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
GLYCOSAMINOGLYACAN TỪ HẢI SÂM
3.1.1. Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra
Glycosaminoglycan (GAG) được phân lập từ Hải sâm Holothuria atra bằng thủy phân với papain, hàm lượng glycosaminoglycan thu nhận được là 5,1% ( bảng 3.1) tính theo trọng lượng mẫu chiết khô sau khi đã ngâm xử lý trong cồn và aceton. Kết quả này cao hơn đáng kể so với hàm lượng glycosaminoglycan (polysaccharide sulfate) từ các loài hải sâm khác trên thế giới đã được công bố như: Stichopus japonicas ở Nhật Bản 0,62% [18];
Apostichopus japonicas 1,7 % [8]; nhưng thấp hơn so với hàm lượng GAG thu nhận được từ các loài hải sâm thuộc cùng chi Holothuria chi như:
Holothuria vagabunda 6,3% ở Ấn Độ Dương [60], Holothuria nobilis 8,3% [4] và một số loài khác chi như: Pearsonothuria graeffei 11,0%, Isostichopus
badionnotus 9,9%, Stichopus tremulus 7,0% [4,18,6], Acaudina molpadioidea
7,6% [1], Stichopus variegatus 6,8% [6]. Tuy nhiên, sự khác nhau về hàm lượng của glycosaminoglycan từ mỗi lồi hải sâm chỉ mang tính chất tương đối và rất khó để đánh giá về sự biến đổi hàm lượng GAG từ các loài hải sâm, sự khác biệt này có thể được giải thích là do sự mỗi lồi hải sâm có những đặc trưng cấu trúc thành tế bào cơ thể khác nhau do vậy các chuỗi carbohydrate liên kết với protein trong thành tế bào cơ thể mỗi loài hải sâm cũng khác nhau. Ngoài ra, hàm lượng glycosaminoglycan hải sâm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: điều kiện địa lý, môi trường sống khác nhau, thời gian thu hoạch và kể cả các kỹ thuật chiết tách khác nhau. [8].
Như vậy, có thể thấy hàm lượng glycosaminoglycan ln có sự biến đổi giữa lồi này với lồi kia kể cả là trong cùng một chi hay giữa các chi hải sâm khác nhau.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết glycosaminoglycan của các loài hải sâm.
Hải sâm Hiệu suất Hải sâm Hiệu suất
chiết chiết
GAG (*%) GAG(*%)
Holothuria atra 5,1% Apostichopus japonicas 1,7 %
[8]
Stichopus japonicas 0,6 % Holothuria vagabunda 6,3 %
[18] [58]
Pearsonothuria 11,0 % Holothuria nobilis 6,3 %
graeffei [4]
Isostichopus 9,9 % Stichopus tremulus 7,0 %
badionnotus
Acaudina 7,6 % Stichopus variegatus [6] 6,8%
molpadioidea [1]
*% tính theo trọng lượng nguyên liệu hải sâm khô
Mẫu glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra được tiến hành đo xác định khối lượng phân tử cũng như mức độ nhiễm tạp bởi các hợp chất khơng mong muốn khác nếu có bằng kỹ thuật sắc ký thẩm thấu gel GPC (Gel Permeation Chromatography). Kết quả sắc ký đồ xác định trọng lượng phân tử của glycosaminoglycan Holothuria atra thu nhận được như trình bày trên hình 3.1. Kết quả trên hình 3.1 cho thấy chỉ xuất hiện một đỉnh duy nhất với mức độ phân tán khối lượng phân tử Mw/Mn = 1,84, chứng tỏ mẫu có sự phân bố về khối lượng phân tử không lớn và mẫu khơng bị nhiễm tạp bởi các nhóm hợp chất khơng mong muốn khác.
Kết quả khảo sát trên cho thấy phương pháp phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra cho hiệu suất chiết tách tương đối cao, khối lượng phân tử phân bố tập trung, độ phân tán khơng nhiều và hồn tồn thích hợp để
áp dụng trong nghiên cứu các đối tượng hải sâm ở vùng biển Việt Nam.
Như vậy, kết quả khảo sát trọng lượng phân tử của glycosaminoglycan không chỉ cho phép đánh giá về khối lượng phân tử trung bình, mức độ phân tán khối lượng của mẫu mà còn giúp đánh giá về chất lượng của sản phẩm ở khía cạnh khơng lẫn tạp chất trong q trình thủy phân hải sâm và thu nhận sản phẩm. Kết quả này cũng có ý nghĩa rất lớn đến các nội dung nghiên cứu tiếp theo trong việc xác định thành phần hóa học cũng như đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra.
Khối lượng phân tử (D)
Hình 3.1. Sắc ký đồ GPC của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 3.1.2. Thành phần hóa học của glycosaminoglycan từ hải sâm
Holothuria atra
Glycosaminoglycan có nguồn gốc từ sinh vật biển nói chung phần lớn là các polymer dị thể với cấu trúc hóa học rất đa dạng, được cấu tạo nên bởi nhiều gốc đường khác nhau và cả nhóm sulfate . Vì vậy phân tích thành phần đường đơn cũng như hàm lượng sulfate là bước quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu
đặc trưng cấu trúc của các glycosaminoglycan.
Theo kết quả (bảng 3.2), hàm lượng tổng carbohydrate của hải sâm
Holothuria atra là (43,5 %) cao hơn với các loại hải sâm: Apostichopus
japonicus (24,7%) [61], Acitinopyga mauritiana (35,59%) [61]; tương đương
với các loại hải sâm: A. Mauritiana (44,62%), B. Marmorata (45,91%), thấp hơn so với các loại hải sâm: Holothuria mexicana (58,54%) [62]. So sánh kết quả hàm lượng sulfate của hải sâm Holothuria atra (23,2% ) (bảng 3.2) với mẫu PS từ hải sâm Apostichopus japonicas [8] được công bố trước đây bởi Liu và cộng sự, hàm lượng Sulfate chiếm 15,74% [63] hay Ludwigothurea
grisea (13,9%) [3], nhận thấy rõ ràng là Hải sâm Holothuria atra có mật độ
sulfate hóa cao hơn nhiều, và có hàm lượng tương đương với các hải sâm khác như Isosticopus badionotus (22,1%) [3], Cucumaria japonica [7]. Kết quả phân tích hàm lượng sulfate của hải sâm Holothuria atra (bảng 3.2) và so sánh với nhiều loại hải sâm khác nhau trên thế giới cho thấy đây là một polymer dị thể sulfate hóa cao. Theo các nghiên cứu trước đó về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học với các đặc trưng cấu trúc của GAG hải sâm đã chứng minh rằng mật độ nhóm sulfate đóng vai trị quan trọng nhất quyết định đến các hoạt tính sinh học của nhóm hợp chất polymer sinh học này . Bên cạnh đó trong thành phần của mẫu GAG này cịn phát hiện thấy sự có mặt của cả uronic axit và protein với hàm lượng lần lượt là 5,9% và 3,2%.
Kết quả phân tích thành phần đường đơn của mẫu GAG từ hải sâm
Holothuria atra (bảng 3.2) cho thấy có tới 04 gốc đường đơn khác nhau tạo nên
PS, trong đó đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic axit (GlcA) là thành phần chính, gốc đường N-Acetyl Galactosamine chiếm ưu thế hơn , cịn có một lượng nhỏ đường Galactose (Gal). Kết quả này rất phù hợp với các cơng bố trước đó về glycosaminoglycan là một polymer dị thể được tạo nên từ nhiều gốc đường khác nhau và nhóm
sulfate [4; 1; 7; 8; 14]. So sánh thành phần đường đơn giữa nghiên cứu glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra (bảng 3.2) với các loại hải sâm trên thế giới, nhận thấy các kết quả này cũng tương tự thành phần đường đơn của glycosaminoglycan từ các loại hải sâm như Thelenata ananas[65], Apostichopus
japonicus, Actinoyaga mauritiana [ 8], Acaudina molpadioidea, Holothuria nobilis [1], trái lại thành phần đường đơn của PS từ các loài hải sâm như
Ludwigothurea grisea, Isosticopus badionotus và Brandthorurea arenicola chỉ
được tạo nên từ 3 gốc đường và chỉ có đường Fucose (Fuc) là thành phần chính, hai gốc đường N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic axit (GlcA) chỉ chiếm một lượng rất nhỏ[3]. Tóm lại, thành phần đường đơn của glycosaminoglycan từ hải sâm phần lớn đều có đặc điểm chung là được tạo nên chủ yếu từ các đường Fucose (Fuc), N-Acetyl Galactosamine (GalNAc) và Glucuronic axit (GlcA), cùng với một hàm lượng nhỏ hoặc không đáng kể các gốc đường đơn khác nhau Galactose (Gal), Glucose (Glu)[1, 66]. Tuy nhiên, mỗi lồi hải sâm đều có sự khác biệt về hàm lượng và thành phần các gốc đường. Sự biến đổi về thành phần đường không chỉ được phát hiện trong các loài hải sâm khác nhau mà cùng một chi hay thậm chí cùng lồi thu
ở những vùng địa lý khác nhau , điều này có thể được lý giải là do ảnh hưởng của điệu kiện môi trường sống khác nhau cũng như các đặc trưng cấu tạo của mỗi loài.
Glycosaminoglycan từ hải sâm được phát hiện gồm có hai nhóm polysaccharide chính là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS) bởi các nhà nghiên cứu người Nhật Bản vào năm 1956 khi họ nghiên cứu và chiết tách glycosaminoglycan từ hai loài hải sâm Apostichopus japonicus
và Cucumarina japonica. Kể từ thời điểm đó trở đi đã có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào đặc trưng hóa học của FCS và FS từ hải sâm Apostichopus
graeffei, Stichopus chemolus, Holothuria vagabunda, Isostichopus badionotus
[20]. Như vậy, có thể thấy các polysaccharides từ hải sâm tương đối phức tạp
về thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc. Vì vậy, để nghiên cứu cấu trúc đặc trưng của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra, các bước tách phân đoạn tinh chế sẽ tiếp tục được thực hiện nhằm làm đơn giản hóa việc nghiên cứu cấu trúc của chúng.
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của GAG từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra
Tổng Tỷ lệ mol giữa các gốc Sulfate Uronic Protein
GAG carbohydrat đường acid
**% **%
% Fuc GlcA GalNAc Gal **%
GAG 43,5 1 0,95 1,13 0,16 23,2 5,9 3,2
**% tính theo khối lượng của mẫu GAG