Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen

Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA cơng nghệ gen Nguyễn Kim Hồn Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS.TS Lê Quang Huấn Năm bảo vệ: 2012 Abstract Nghiên cứu Gen scFv mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu chu trình nhiệt phù hợp, sau đưa vào vector phagemid pHEN2 để tạo vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp pHEN2-scFv biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.Coli chủng TG1 có bổ sung kháng sinh ampicillin, khuẩn lạc mọc đĩa kiểm tra chọn lọc dòng mang vector Kháng thể phage-scFv tạo kết hợp với kháng nguyên EPCA huyết bệnh nhân bị bệnh không bị bệnh để kiểm tra lực thông qua phản ứng ELISA Bước đầu sử dụng để chẩn đốn bệnh nhân dương tính hay âm tính với ung thư tiền liệt tuyến Keywords Sinh học thực nghiệm; Công nghệ gen; Gen mã hóa; Ung thư tiền liệt tuyến Content LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, ung thư coi bệnh đe dọa nguy hiểm trầm trọng người Trong số đó, ung thư tuyến tiền liệt loại ung thư thường gặp có tỉ lệ tử vong cao nam giới Ung thư tuyến tiền liệt gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe sinh hoạt nam giới, phát sớm điều trị kịp thời hạn chế nhiều tác hại bệnh Ngày với phát triển y học sinh học phân tử, có thêm nhiều phương pháp chẩn đốn điều trị Một phương pháp hữu hiệu phương pháp sử dụng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt chẩn đốn điều trị cách nhanh chóng hiệu Kháng thể scFv chuỗi hợp vùng biến thiên chuỗi nặng (VH) vùng biến thiên chuỗi nhẹ (VL) kháng thể nhờ chuỗi peptide ngắn (10-25 axit amin) Với cấu trúc này, scFv giữ đặc trưng kháng thể ban đầu, loại bỏ vùng định có thêm xuất chuỗi peptide làm cầu nối vùng VH VC Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đưa kháng thể vào ứng dụng chẩn đoán điều trị ung thư tiền liệt tuyến tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA công nghệ gen.” CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1 Giới thiệu chung tuyến tiền liệt Tuyến tiền liệt quan nằm bụng hay cổ bàng quang (hình 1) Là tuyến bao quanh đoạn đầu niệu đạo Tuyến tiền liệt khối hình nón mà đáy trên, đỉnh Tuyến rộng 4cm, cao 3cm dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g thường to lên theo tuổi (hình 2) [1] Tuyến tiền liệt tiết chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm chứa acid citric, calcium, acid phosphat, enzyme làm đơng vón profibrinolysin Trong thời gian phóng tinh, túi tuyến tiền liệt co bóp với co bóp ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết gộp với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch Dịch tiết có tính kiềm trung hịa bớt độ acid tinh dịch (độ acid diện sản phẩm trao đổi chất tinh trùng), mà giúp tinh trùng đạt khả vận động thụ tinh mức tối ưu Một chức khác tuyến tiền liệt giúp kiểm soát nước tiểu cách tạo áp lực trực tiếp phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh’ Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) loại ung thư phổ biến nước ta nước giới Bệnh chiếm 10% số ung thư nam giới, nước tiên tiến tỷ lệ 15% nguyên nhân tử vong thứ hai bệnh ung thư, sau ung thư phổi Theo thống kê, hàng năm Mỹ có đến 132.000 người Mỹ bị UTTLT, khoảng 34.000 người tử vong bệnh Ung thư tuyến tiền liệt khối u ác tính phát triển từ tế bào tuyến tiền liệt Khối u thường phát triển chậm kéo dài nhiều năm Trong suốt thời gian này, khối u thường có khơng có biểu triệu chứng bất thường khám bệnh Tuy nhiên, ung thư tiến triển, khối u lớn lên xâm lấn sang mô xung quanh (lan rộng chỗ) Hơn nữa, ung thư di (lan xa hơn) đến vùng khác thể xương, phổi, gan Triệu chứng nơi di kết hợp với triệu chứng UTTLT [8] Nguyên nhân gây UTTLT chưa nghiên cứu rõ, UTTLT khơng liên quan đến phì đại tuyến tiền liệt lành tính Các yếu tố nguy bị UTTLT bao gồm: lớn tuổi, di truyền, ảnh hưởng nội tiết tố chất độc mơi trường, hóa chất sản phẩm cơng nghiệp Tầm sốt UTTLT việc cần làm thường xuyên cách nhằm phát UTTLT giai đoạn sớm Nếu kết tầm soát bình thường coi khơng mắc bệnh, kết bất thường nghi ngờ có bệnh cần làm thêm số xét nghiệm khác để chẩn đốn Khi có hai xét nghiệm tầm sốt có bất thường UTTLT nghi ngờ Các thăm khám tầm soát bao gồm:  Thăm khám tuyến tiền liệt ngón tay qua ngả trực tràng: Qua ngả trực tràng, người thăm khám sờ thấy bề mặt sau chiếm đến 75% diện tích chung tuyến, nằm phần cuối ruột già Qua sờ thấy khối u to ra, mật độ không đều, chỗ cứng chỗ mềm dễ phát [7]  Siêu âm nội trực tràng: để tìm xác độ lớn, vị trí khối u giúp bác sỹ chích sinh thiết tế bào tuyến để khám nghiệm thể bệnh lý học [7]  Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu tiền liệt tuyến): Đây xét nghiệm đơn giản, dễ thực tương đối xác PSA enzyme glucỏpotein, tiết biểu mô tuyến tiền liệt, có trọng lượng phân tử khoảng 30.000, chứa 240 axit amin với 7% carbonhydrat, có vai trị làm lỗng tinh dịch Đây kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt, bệnh nhân bị UTTLT nồng độ PSA thường tăng cao tỷ lệ với thể tích khối ung thư Tuy nhiên không đặc hiệu riêng với UTTLT, nồng độ PSA tăng bị viêm tuyến tiền liệt Xét nghiệm dùng để phát lượng PSA, nhiên PSA có giá trị xét nghiệm tầm sốt UTTLT Vì bác sỹ thường khun người đàn ông 50 tuối nên làm xét nghiệm PSA năm lần để phát sớm bệnh UTTLT Ở người có nguy UTTLT bác sỹ khuyên nên bắt đầu làm xét nghiệm PSA sớm tuổi 40 1.1.2 Các phƣơng pháp điều trị bệnh UTTLT Để định điều trị cho bệnh nhân, bác sỹ xếp loại UTTLT chỗ, u lớn chưa lan hay di Chọn lựa điều trị tùy theo mức độ lan ung thư, ung thư khu trú chỗ điều trị bao gồm: phẫu thuật, xạ trị, hormone liệu pháp, đơng lạnh biện pháp kết hợp với Còn trường hợp UTTLT di thường không điều trị Điều trị UTTLT di bao gồm: hormone liệu pháp, hóa trị, nhiên tạm thời Mục tiêu điều trị tạm thời làm cho khối u chậm phát triển, giảm triệu chứng cho người bệnh 1.2 KHÁNG NGUYÊN 1.2.1 Khái niệm Kháng nguyên (antigen) định nghĩa chất tương tác với phân tử kháng thể thụ thể tế bào lympho Một chất gây miễn dịch kháng nguyên thể nhận biết chất ngoại lai kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng 1.2.2 Kháng nguyên EPCA ( Early Prostate Canner Antigen) EPCA protein có chất nhân tế bào Điều đặc biệt EPCA biểu mạnh mơ ung thư mơ bình thường sát kề mô ung thư bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, lại không biểu mô tuyến tiền liệt người không bị ung thư, xác định thị EPCA làm giảm nguy trường hợp âm tính giả sinh thiết EPCA có khối lượng phân tử khoảng 40kDa điểm đẳng điện khoảng 6,73 Sử dụng kháng nguyên EPCA phát mầm bệnh bệnh nhân sớm 1-2 năm trước có biểu hình thái ung thư tuyến tiền liệt Các kháng thể kháng EPCA có hiệu yếu tố góp phần nghiên cứu bệnh lý mẫu sinh thiết tiền liệt tuyến để phát ung thư tuyến tiền liệt sớm so với làm sinh thiết nhiều lần, có tiềm giới hạn số lần làm sinh thiết bệnh nhân [26] 1.3 KHÁNG THỂ 1.3.1 Cấu trúc Kháng thể sản phẩm đặc hiệu hệ miễn dịch tổng hợp giúp thể công tác nhân gây bệnh Các kháng thể immunoglobulin (có chất glycoprotein), tế bào lympho B, tương bào (biệt hoá từ lympho B) tổng hợp tiết giúp hệ miễn dịch nhận biết vơ hiệu hố tác nhân lạ, chẳng hạn vi khuẩn virus [4] Chuỗi nhẹ Có trọng lượng phân tử 25kDa, chứa khoảng 211 – 221 axit amin Có hai loại chuỗi nhẹ kappa (Қ) lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chứa hai chuỗi nhẹ Қ hai chuỗi nhẹ λ mà không chứa hai loại Mỗi chuỗi nhẹ Ig chứa hai vùng axit amin: vùng biến đổi (VL) nằm đầu phía đầu amin (-NH2) phân tử vùng cố định (CL) nằm phía đầu cacboxyl (-COOH) [4,6 Chuỗi nặng Trọng lượng phân tử chuỗi nặng khoảng 50 kDa, chứa khoảng 450 axit amin Có loại chuỗi nặng γ, μ, α, δ ε ứng với lớp kháng thể IgG, IgM, IgA, IgD IgE [6] Mỗi chuỗi nặng có vùng axit amin: vùng biến đổi (VH) nằm phía đầu amin ba vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl ký hiệu CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi chuỗi nặng chuỗi nhẹ nằm kề tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop đảm bảo tính đa dạng phân tử kháng thể [6] 1.3.2 Mảnh kháng thể Hai mảnh kháng thể thiết kế gắn với kháng nguyên – Fab Fv tách dòng bộc lộ phage Mảnh kháng thể lớn – Fab gồm phần VH – CH VL – CL liên kết với cầu disulfide, mảnh kháng thể nhỏ – Fv bao gồm vùng VH VL Dạng tái tổ hợp Fv mảnh biến đổi đơn chuỗi nối với đoạn peptide, thường gồm 15 axit amin có trình tự (Gly4Ser)3 biểu chuỗi polypeptide đơn Đoạn nối cho phép vùng biến đổi chuỗi nặng (VH) kết hợp với vùng biến đổi chuỗi nhẹ (VL) tạo thành phân tử đơn chuỗi Phân tử tái tổ hợp tạo bảo tồn hoạt tính nhận biết liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích [45] Đặc điểm mảnh kháng thể khác tóm tắt bảng 1.3.3 Kháng thể tái tổ hợp Kháng thể tái tổ hợp thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán điều trị [25] Nhu cầu sử dụng kháng thể nghiên cứu khoa học, chẩn đoán điều trị bệnh ngày lớn, đặc biệt kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nguồn kháng thể người thường khó kiếm Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận kháng thể từ động vật gây miễn dịch sau nhân tính hố để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch sử dụng 1.3.4 Kháng thể đặc hiệu loại kháng nguyên Phản ứng kháng nguyên - kháng thể đặc hiệu, để thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đích ta cần hiểu rõ mối tương tác kháng nguyên - kháng thể, xác định nét đặc trưng kháng thể kháng nguyên có nguồn gốc, chất khác 1.3.5 Các phƣơng pháp tạo kháng thể Nhu cầu sử dụng kháng thể nghiên cứu khoa học, chẩn đoán điều trị bệnh ngày lớn, đặc biệt kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc người Vì vậy, phương pháp chung để nhận kháng thể từ động vật gây miễn dịch sau nhân tính hóa để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch sử dụng Đáp ứng miễn dịch dịch thể thể hình thành có kháng ngun xâm nhập cảm ứng tạo loại kháng thể Các kháng thể huyết động vật gây miễn dịch với kháng nguyên đích sau tinh sử dụng công cụ nghiên cứu hiệu sử dụng trực tiếp điều trị Tuy nhiên kháng thể đa dịng có tính đặc hiệu khơng cao, tập hợp kháng thể nhận biết epitope khác kháng nguyên đích Vì vậy, việc tìm phương pháp tạo kháng thể đơn dịng Kohler Milstein đóng vai trò quan trọng nghiên cứu thu nhận kháng thể đơn dịng với tính đặc hiệu cao Phương pháp thu nhận kháng thể đơn dòng Kohler Milstein (1975) bao gồm bước: - Gây miễn dịch cho chuột kháng nguyên đích - Tạo tế bào lai cách dung hợp tế bào lympho B (đã hoạt hóa kháng ngun đích kháng ngun sử dụng để gây miễn dịch) tách từ lách chuột với tế bào myeloma chuột - Chọn lọc tế bào lai có khả sản xuất kháng thể đơn dịng đặc hiệu kháng ngun đích Sử dụng dịng tế bào lai chọn để sản xuất kháng thể đơn dịng cách tạo báng chuột ni cấy tế bào môi trường đặc biệt 1.4 THƢ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THỂ Trước đây, cách gây miễn dịch động vật theo kỹ thuật tế bào lai sử dụng để tạo kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên (có tính đa dạng cao) Những tiến sinh học phân tử cho phép sử dụng vi khuẩn Escherichia coli việc sản xuất kháng thể tái tổ hợp Với kích thước giới hạn mảnh kháng thể Fab, Fv, scFv không biểu bề mặt tê bào vi khuẩn mà bộc lộ bề mặt thực khuẩn thể (phage) cách dung hợp với protein vỏ phage Phage hình sợi nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, chúng gây nhiễm nhiều vi khuẩn Gram âm khác Đặc điểm chung chúng hệ gen mạch vòng đơn bao bọc lớp vỏ dài dạng ống, tương đối linh động cấu tạo hàng nghìn loại protein chủ yếu vài loại protein thứ yếu phân bố hai đầu ống Hệ gen phage hình sợi nhỏ, có khoảng 10 gen phân bố sát vùng không mã hóa (vùng IG) chứa trình tự cần thiết cho nhân đóng gói phage Khơng giống với virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi tổng hợp giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ Hầu hết thơng tin phage hình sợi nhận từ nghiên cứu phage f1, M13, fd phần nhỏ từ phage Ike Các phage f1, M13, fd sử dụng để biểu lộ chuỗi polypeptide Hệ gen phage hình sợi có tương đồng với 98% sản phẩm gen chúng thay cho phage gọi chung phage Ff Tính đặc hiệu kháng thể phụ thuộc vào vùng định tính bổ trợ (CDR): vùng CDR chuỗi nặng vùng CDR chuỗi sử dụng chẩn đoán điều trị ung thư, (ii) phân tách kháng thể từ người bệnh virus để hiểu tốt đáp ứng miễn dịch trình xâm nhiễm virus, (iii) làm sáng tỏ tính đặc hiệu kháng thể tự miễn nghiên cứu tương tác phân tử Các đoạn kháng thể dạng Fab scFv bộc lộ bề mặt thực khuẩn thể M13 mà không lực tính đặc hiệu kháng nguyên Về bản, để tạo thư viện kháng thể cần khuếch đại đoạn gen mã hóa chuỗi nặng chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết lympho bào máu ngoại biên phiên mã ngược PCR Cắt sản phẩm PCR enzyme giới hạn tách dòng vào vector phagemid để biểu dung hợp với protein phage [27] Thơng thường trình tự gen tái tổ hợp mã hóa đoạn kháng thể nối với đầu N gen mã hóa protein vỏ pIII pVIII gắn với đầu N protein vỏ pVII, pIX Chất lượng thư viện kiểm tra theo thơng số sau:  Số lượng dòng chứa phagemid mang đoạn scFv  Số lượng dòng biểu phage mang scFv  Số lượng dòng biểu kháng thể scFv hòa tan Một số thư viện tạo sử dụng phổ biến Nissim Library, tạo phịng thí nghiệm Dr.G.Winter Cambridge (1994), thư viện De Kruif cộng (1995) Nổi bật thư viện tổng hợp Fab scFv Griffiths cộng tạo Cách đơn giản thường sử dụng cố định phân tử đích giá thể cho dung dịch chứa phage qua Một số biến thể phương pháp sử dụng thành công bao gồm cố định tên ống phiến kính có bề mặt biến đổi hóa học, cột bề mặt hạt từ Có thể cố định số phân tử sinh học phương pháp hấp phụ thụ động ống polystyrene có bề mặt biến đổi thích hợp MaxiSorp TM sử dụng đích biotin hóa Các phương pháp sàng lọc tân tiến áp dụng bao gồm sàng lọc với tồn tế bào sống, với phân đoạn mơ cố định chí động vật sống CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Sinh phẩm - Gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên UTTLT cung cấp từ nguồn gen thiết kế thuộc phịng Cơng nghệ tế bào động vật, viện Công nghệ sinh học - Phagemid pHEN2 - E.coli chủng TG1 trung tâm Công nghệ Protein MRC Vương Quốc Anh cung cấp - Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish peroxidase-conjugate) hãng Amersham Biosciences, USA - 31 mẫu máu bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến khoa hóa sinh, bệnh viện Bạch Mai cung cấp 2.1.2 Hóa chất Hóa chất sử dụng hóa chất tiêu chuẩn chuyên dùng cho sinh học phân tử hãng hóa chất có uy tín Invitrogen, Fermentas… cung cấp hóa chất khác phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học: Cao nấm men (Yeast extract), Tryptone, Agar, Ampicillin, Tris-HCl, EDTA, NaOH, SDS, EtBr, Phenol, Chloroform, isoamyl alcohol, acid acetic, nước khử ion vô trùng, BSA, Taq buffer, CaCl2… 2.1.3 Trang thiết bị  Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức)  Máy lắc ổn nhiệt  Bể ổn nhiệt  Lị vi sóng (Samsung)  Tủ lạnh sâu (-200C, -850C);  Máy Voltex (Rotolab, OSI)  Máy điện di  Máy đo pH  Tủ cấy vô trùng  Pipetman loại (Gilson, Pháp)  Máy soi chụp gel (Pharmacia) thiết bị khác chủ yếu thuộc phịng thí nghiệm trọng điểm, Viện Cơng nghệ Sinh học 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Nhân gen kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.2.2 Phƣơng pháp cắt gắn DNA 2.2.3 Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến E.coli TG1 2.2.4 Biến nạp Plasmid vào tế bào E.coli 2.2.5 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật Các chủng vi khuẩn nuôi cấy bình tam giác với thể tích từ 20 – 50 ml chứa 515ml mơi trường thích hợp cho loại Bình ni cấy đặt máy lắc ổn nhiệt 370C với tốc độ lắc 220v/ph 2.2.6 Phƣơng pháp giữ chủng Các khuẩn lạc đơn trải môi trường thạch thích hợp, ủ 370C qua đêm Sau đó, giữ đĩa thạch chứa chủng 40C vòng tuần 2.2.7 Phƣơng pháp điện di gel Agarose DNA tích điện âm có khả chuyển động điện trường theo chiều từ cực âm đến cực dương Tốc độ chuyển động chúng điện trường có hiệu điện khơng đổi phụ thuộc vào yếu tố: Dạng tồn DNA, kích thước DNA, nồng độ agarose gel hiệu điện hai cực Các DNA có kích thước lớn chuyển động chậm, DNA dạng siêu xoắn chuyển động nhanh DNA dạng thẳng Trong phạm vi định nồng độ gel agarose Thường đoạn gen có kích thước từ 300 – 10.000 bp phân tách gel agarose 0,8% Đoạn gen nhỏ nồng độ agarose phải tăng lên 2.2.8 Xác định trình tự nucleotide DNA máy giải trình tự sở phƣơng pháp dideoxy (Sanger) Nguyên tắc: Sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang để làm ngừng mạch đơn DNA tổng hợp cách ngẫu nhiên Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn nucleotide vào mạch đơn DNA tổng hợp vị trí 3’- OH, gặp ddNTP (khơng có nhóm 3’- OH) phản ứng tổng hợp bị ngừng lại 2.2.9 Chuẩn bị thƣ viện phage 2.2.10 Bộc lộ mảnh kháng thể scFv phage M13 2.2.11 Phƣơng pháp ELISA ELISA kỹ thuật hóa sinh sử dụng chủ yếu miễn dịch học để phát có mặt kháng thể kháng nguyên mẫu ELISA sử dụng cơng cụ phân tích y học bệnh học, phép kiểm tra chất lượng nhiều ngành công nghiệp khác Trong ELISA, lượng kháng nguyên chưa biết cố định bề mặt, sau kháng thể đặc hiệu đưa vào để chúng liên kết với kháng nguyên Những kháng thể gắn với enzyme, bước cuối chất thêm vào để enzyme chuyển chúng thành tín hiệu phát Vì trường hợp ELISA fluorescence, ánh sáng với bước sóng thích hợp chiếu vào mẫu, phức hệ kháng nguyên-kháng thể phát sáng đủ để lượng kháng nguyên mẫu đo thông qua cường độ phát sáng CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết nhân gen mã hóa mảnh kháng thể scFv PCR Để thu gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA bệnh ung thư tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, thực phản ứng nhân gen kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu: TTLF: 5’GGCCCCATGGCCATTGCGGGCCTG – 3’ TTLR: 5’- GATGTGCGGCCGCACGTTTGATTTC – 3’ Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gen agarose hình 1: M 500 bp Hình 1: Điện di sản phẩm PCR M: Marker DNA 1kb ( Fermentas), G1: Sản phẩm PCR Hình ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR thu đặc hiệu, kết phù hợp với tính tốn lý thuyết, băng thu có kích thước mong muốn 496 bp Như vậy, khẳng định chúng tơi nhân thành cơng gen scFv mã hóa cho mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA UTTLT, gen thu mang hai vị trí cắt hai enzyme giới hạn NcoI NotI 3.2 Kết tạo vector tái tổ hợp pHEN2 - scFv Từ nguồn sản phẩm PCR thu trên, sử dụng enzyme giới hạn NotI NcoI xử lý chúng để tạo hai đầu dính giúp cho việc gắn gen vào phagemid dễ dàng Tương tự, phagemid pHEN2 xử lý với hai enzyme tạo hai đầu dính bổ sung Hỗn hợp phản ứng ủ bể ổn nhiệt 37oC thời gian 16 Sau đó, sản phẩm cắt điện di gel agarose tiến hành tinh từ gel để thu gen scFv phagemid pHEN2 có hai đầu dính đảm bảo cho phản ứng nối gen Sau nhờ enzyme nối T4 ligase nối hai đầu dính đoạn gen scFv vào vector mở vòng pHEN2 Thực biến nạp phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pHEN2 vào vi khuẩn E.coli chủng TG1 theo quy trình 2.2.4 trình bày Phagemid pHEN2 có chứa đoạn gen kháng kháng sinh ampicillin nên vector biến nạp vào vi khuẩn E.coli thành công tế bào chứa phagemid sống sót mơi trường có ampicillin Cịn tế bào khơng nhận vector khơng mọc đĩa LB có bổ sung ampicillin Hình 2: Kết biến nạp sản phẩm nối ghép phagemid pHEN2 với gen scFv vào E.coli chủng TG1 Kết biến nạp cho thấy đĩa LB-agar, khuẩn lạc trắng mọc riêng rẽ phân biệt mắt thường Như vậy, trình biến nạp vector tái tổ hợp vào E.coli TG1 thành công Tuy nhiên, xuất khuẩn lạc khẳng định tế bào vi khuẩn TG1 thu có chứa phagemid pHEN2 cịn pHEN2 chứa gen scFv hay chưa chưa xác định Do đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra chọn dịng tế bào TG1 chứa phagemid tái tổ hợp 3.3 Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT Để tiến hành chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT sử dụng phương pháp PCR khuẩn lạc khuẩn lạc chọn để tiến hành PCR phagemid gốc với cặp mồi vector pHEN2 có tên LabF/R chu trình nhiệt phù hợp Cặp mồi LabF/R thiết kế nằm hai phía vùng cắt gắn đa điểm, vector gốc chưa gắn thêm đoạn gen ngoại lai sau PCR với mồi Lab thu sản phẩm khoảng 200 bp, vector gắn thêm đoạn gen ngoại lai sản phẩm PCR thu có kích thước kích thước gen ngoại lai cộng với 200 bp Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 18: M 700bp 750bp Hình 3: Kết PCR từ khuẩn lạc chọn dòng chủng TG1 chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2scFv G1-7: Các khuẩn lạc từ 1-7 Kết điện di hình 18 cho thấy khuẩn lạc 1,2,3,5 cho băng điện di có kích thước mong muốn khoảng 700bp, khuẩn lạc 4,6,7 khơng nhìn thấy băng Điều chứng tỏ khả dòng tế bào 1,2,3,5 chứa phagemid tái tổ hợp pHEN2-scFv Tuy nhiên, để khẳng định chắn tiến hành tách chiết phagemid xác định trình tự, đồng thời kiểm tra gen mã hóa scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA UTTLT gắn vào pHEN2 có chiều khung đọc hay khơng 3.4 Xác định trình tự gen scFv phagemid tái tổ hợp pHEN2/scFv Trong dịng TG1 có khả mang phagemid tái tổ hợp xác định sơ phương pháp PCR từ khuẩn lạc, chọn khuẩn lạc số cho băng sắc nét để nhân ni mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicilline (100 μg/ml) tách chiết phagemid Kết tách chiết phagemid tái tổ hợp thể hình Hình Kết tách chiết phagemid tái tổ hợp Giếng 1,2: Các phagemid tách chiết từ khuẩn lạc số Phagemid thu được tiến hành xác định trình tự với mồi LabF sử dụng kit “Big Dye Terminator sequencing kit” (ABI, Mỹ) thực máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer theo phương pháp Sanger cs Kết thu được thể hình ATCCTATTGC CTACGGCAGC CGCTGGATTG TTATTACTCG CGGCCCAGCC 51 GGCCATGGCC ATTGCGGGCC TGGCGACCCC GGGCTGGAGC CATTGGCTGG 101 CGCTGACGCC ATGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGTCGACCTC GAGTGGTGGA 151 GGCGGTTCAG GCGGAGGTGG CTCTGGCGGT AGTGCACTTG AGATTGTGAT 201 GACCCAGACT CCACTCTCCT CACCTGTCAC CCTTGGACAG CCGGCCTCCA 251 TCTCCTGCAG GTCTAGTCAA AGCCTCGTAC ACAGTGATGG AAACACCTAC 301 TTGAGTTGGC TTCAGCAGAG GCCAGGCCAG CCTCCAAGAC TCCTAATTTA 351 TAAGATTTCT AACCGGTTCT CTGGAGTGCC AGATAGGTTC AGTGGCAGCG 401 GGTCAGGGAC AGATTTCACA CTGAAAATCA GCAGGGTGGA AGCTGAGGAT 451 GTCGGGGTTT ATTACTGCAT GCAAGCTGCA CAATTTCGCC GTTCTACGTT 501 CGGCCAGGGG ACCAAGCTGG AAATCAAACG TGCGGCCGCA CTCGAGCACC 551 ACCACCACCA CCACTGA Hình 5: Trình tự gen scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA UTTLT Các chữ màu đỏ: trình tự gen scFv; chữ màu đen: phần trình tự phagemid pHEN2 Từ trình tự gen thu để tiến hành kiểm tra xem gen scFv gắn vào phagemid pHEN2 chiều khung đọc hay chưa, chúng tơi tiến hành suy diễn trình tự amino acid phần mềm chuyên dụng, kết thu sau: ILLPTAAAGL LLLAAQPAMA IAGLATPGWS HWLALTPWPR CSCRSTSSGG 51 GGSGGGGSGG SALEIVMTQT PLSSPVTLGQ PASISCRSSQ SLVHSDGNTY 101 LSWLQQRPGQ PPRLLIYKIS NRFSGVPDRF SGSGSGTDFT LKISRVEAED 151 VGVYYCMQAA QFRRSTFGQG TKLEIKRAAA LEHHHHHH* Hình 6: Trình tự amino acid suy diễn Kết thu giúp chúng tơi khẳng định chắn gen mã hóa cho scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA gắn vào phagemid pHEN2 theo chiều khung đọc đảm bảo cho trình bộc lộ scFv bề mặt phage 3.5 Kết bộc lộ mảnh kháng thể scFv phage M13 E.coli chủng TG1 chứa phagemid-scFv chọn nhân nuôi 37oC đến đạt OD600 = 0,5 sau hiễm helper phage M13 vào để hỗ trợ việc hình thành phage-scFv cách hoàn chỉnh theo phương pháp 2.2.10 Một điểm mạnh kỹ thuật phage display mối tương quan kiểu gen kiểu hình, gen phage thực chất phagemid vector (pHEN2 vector) M 750bp 700bp Hình : Kết điện di sản phẩm PCR M: Marker DNA 1kb ( Fermetas); G 1,2: Mẫu PCR kiểm tra với nồng độ khn khác Từ kết hình cho thấy thu băng có kích thước mong muốn khoảng 700bp Chứng tỏ kháng thể scFv biểu thành công bề mặt phage Để xác định xác lượng kháng thể tạo tiến hành đo nồng độ máy nanodrope bước sóng 269nm Kết sau lần chuẩn phage tính giá trị trung bình cho chúng tơi kết 3.10 mũ phân tử kháng thể ml dịch thu phage Như vậy, chứng tỏ trình bộc lộ kháng thể ung thư tiền liệt tuyến scFv bề mặt phage M13 thành công 3.6 Kết thực phản ứng ELISA kháng thể phage-scFv với huyết bệnh nhân Với kháng thể phage-scFv thu chúng tơi sử dụng để chẩn đốn bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến cách thực phản ứng ELISA kết hợp với huyết máu bệnh nhân Huyết bệnh nhân bị bệnh có chứa kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA kết hợp đặc hiệu với kháng thể thu Trong thí nghiệm sử dụng 20 mẫu huyết bệnh nhân bị bệnh ung thư tiền liệt tuyến u xơ tiền liệt tuyến lành tính cung cấp từ bệnh viện Bạch Mai Bảng 2: Kết ELISA mẫu huyết bệnh nhân: Huyết OD450 Huyết OD450 Huyết OD450 Huyết OD450 nm nm nm nm 0,157 0,195 0,167 0,179 0,183 0,187 0,147 0,156 10 11 12 13 14 15 16 0,048 0,030 0,027 0,027 0,026 0,031 0,035 0,028 17 18 19 20 21 22 23 24 0.035 0.032 0.029 0.037 0.043 0.046 0.039 0.040 25 26 27 28 29 30 31 32 0.029 0.037 0.036 0.037 0.039 0.042 0.043 0.035 Kết biểu thị sơ đồ: OD 450 20 mẫu huyết bệnh nhân 10 mẫu huyết thường Hình 8: Kết phản ứng ELISA đo bước sóng 450nm Kết cho thấy: Trong mẫu bệnh nhân, mẫu từ số 1-8 bệnh nhân bị bệnh có lực cao hẳn so với mẫu lại từ 9-20 bệnh nhân âm tính với UTTLT Các giếng đối chứng từ 21-31 cho giá trị OD thấp tương đương với mẫu không bị bệnh Mặt khác, thấy tất giếng người bình thường khơng có kháng ngun EPCA (9-31) giếng đối chứng cho giá trị OD450 0.05, mẫu bị bệnh cho giá trị OD450 cao 0.15 Điều chứng tỏ sử dụng kháng thể phage-scFv chẩn đoán bệnh ung thư tiền liệt tuyến cho kết ổn định xác, hồn tồn thử nghiệm thành cơng với số lượng bệnh phẩm lớn có ý nghĩa thống kê KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã thiết kế thành công phagemid tái tổ hợp pHEN2 mang gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA bệnh ung thư tuyến tiền liệt  Đã thu nhận kháng thể tái tổ hợp phage-scFv gắn đặc hiệu với kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA kỹ thuật phage display  Kiểm tra thành cơng tính đặc hiệu kháng thể scFv thu phản ứng ELISA KIẾN NGHỊ  Tiếp tục nghiên cứu quy trình chẩn đốn bệnh ung thư tiền liệt tuyến kĩ thuật ELISA xác để ứng dụng vào y học  Nghiên cứu biểu kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến chẩn đoán  References TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT http://truongton.net/forum/showthread.php?t=250851 http://truongton.net/forum/showthread.php?t=45671 http://www.angelfire.com/ks3/hodacduy0/yhoc_03_UngThuTuyenTienLiet.htm Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009) - Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Hà Nội, 2009 Nguyễn Văn Tuấn, Ung thư tuyến tiền liệt vấn đề thông tin y khoa Phạm Văn Ty (2004) - Miễn dịch học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Tôn Thất Hứa (2005), Ung thư tiền liệt tuyến : Phát sớm – kết tốt, Đại học y khoa Wuerzburg, CHLB Đức TÀI LIỆU TIẾNG ANH A Heidenreich, M Bolla, S Joniau et al (2010), Guidelines on Prostate Cancer, European Association of Urology Andris-Widhopf, Steinberger, Barbas, (2001), “Bacteriophage display of combinatorial antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences 10 Anna M Wu, Tove Olafsen, Andrew A Raubitschek (2007), Engineered anti- CD20 antibody fragments for in vivo targeting and therapeutics, United States Patent Application Publication, Pub No US 2007/0280882 Pub date Dec 2007 p 1-12 11 Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Winter G (1991), “Making antibody fragments using phage display libraries”, Nature 352: 624–8 12 David M Glodenberg, Robert M Sharkey, Jaques Barbet, Jean Francois Chatal ( 2007), Radioactive antibodies: selective targeting and treatment of cancer and other diseases, Appl Radiol 2007; 36(4) 13 Drudge-Coates L, Turner B (2012), “Prostate cancer overview Part 2: metastatic prostate cancer”, pp.11-24 14 Gregore and Louis (2005) Review on “ Monoclonal antibody therapy of cancer” Nature Biotechnology 23, 1147-1157 15 Griffiths, Dand Duncan, (1998), “Strategies for selection of antibodies by phageDisplay”, Curr Opin Biotechnol Vol 9, pp 102–108 16 Griffiths, Andrew, David Hoogenboom, Hendricus, Renerus, Jacobus, Mattheus Marks, James, David McCafferty, John Winter, Gregory, Paul Grigg, Geoffrey, Walter (1993), “Productiion of anti-sefl antibodies from antibody segment repertories and displayed on phage” WIPO 17 Guan, Zhang, Wang, (1995), “Electrostatic potential distribution of the gene V protein from Ff phage facilitates cooperative DNA binding: a model of the GVP-ssDNA complex”, Protein Sci 4:187 18 Hoogenboom, Chames, P (2000), “Natural and designer binding sites made by phage display technology”, Immunology Today 21, 371 19 Hoogenboom, de Bruine AP, Hufton SE, Hoet RM, Arends JW, Roovers RC (1998), “Antibody phage display technology and its applications”, Immunotechnology 4:1–20 20 Jame boye, T Elter & A Engert ( 2003) An overview of the current clinical use of the anti- CD20 monoclonal antibody rituximab Annals of Oncology 14 p 520- 535, 2003 21 J Ramon Denis (Eds) (2007), Prostate cancer, Belgium 22 Janice M R, et al ( 2005) Monoclonal antibody successes in the clinic Nature Biotecnology, 23(9), p.1073-1078 23 Jingjing You, Paul Cozzi, Bradley Walsh, Mark Willcox, John Kearsley, Pamela Russell, Yong Li (2009), Innovative biomarkers for prostate cancer early diagnosis and progression, Introduction p11 24 Johns M, George, Ritter (2000), “In vivo selection of scFv from phage display libraries”, J Immunol Meth 239:137-151 25 Jordan E., Hust M., Roth A., Biedendieck R., Schirrmann T., Jahn D., Dübel S (2007) “Production of recombinant antibody fragments in Bacillus megaterium”, Microbial Cell Factories 26 Jurol., Hansel DE, DeMarzo AM, Platz EA, Jadallah S, Hicks J, Epstein JI, Partin AW, Netto GJ (2007) May, “Early prostate cancer antigen expression in predicting presence of prostate cancer in men with histologically negative biopsies”, 177(5):173640 27 Kehoe, J Wash, Kay, (2005), “Filamentous phage display in the new millennium”, Chem Rev 105:4056-4072 28 Knappick, L.; Honegger, A.; Pack, P.; Fischer, M.; Wellnhofer G.; Hoess A,; Wolle; Pluă ckthun, A.; Virnekas, B (2000), “Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides”, J Mol Biol 296 29 Kohler G., Milstein C (1975), “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”, Nature, 256, pp.495- 497 30 Kohler, Milstein (1975).Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefines specificity Nature 256, 495-497 31 Konings, Folmer, Folkers, P J Nilges, Hilbers, (1995), “Three-dimensional structure of the single-stranded DNA-binding protein encoded by gene V of the filamentous bacteriophage M13 and a model of its complex with single-stranded DNA”, FEMS Microbiol Rev 17:57-72 32 Mead DA, Kemper B (1988), “Chimeric single-stranded DNA phage-plasmid cloning vectors”, Biotechnology 10:85–102 33 Morrow AL, Rangel JM Semin Pediatr Infect Dis 2004 “Human milk protection against infectious diarrhea: implications for prevention and clinical care” 34 Muyldermans, S (2001), “Single domain camel antibodies: current status”, J Biotechnol 74, 277 35 Nakamura, M., Tsumoto, K., Kumagai, I., Ishimura, K (2003), “A morphologic study of filamentous phage infection of Escherichia coli using biotinylated phages”, FEBS Lett 536:167-172 36 Neri D, Petrul H, Roncucci G (1995), “Engineering recombinant antibodies for immunotherapy”, Cell Biophys 27:47–61 37 Nissim A, Hoogenboom HR, Tomlinson IM, et al (1994), “Antibody fragments from a ’single pot’ phage display library as immunochemical reagents”, EMBO 13:692–8 38 Pacini, L., Vitelli, A., Filocamo, G., Bartholomew, L., Brunetti, M., et al 2000 In vivo selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries J Virol 74:10563-10570 39 Philipp Holliger & Peter Hudson, (2005), Engineered antibody fragment and the rise of single domains, natural biotechnology 40 Rader, C (2001), “Antibody libraries in drug and target discovery”, Drug Discovery Today 6, 36 41 Riechmann, L., Holliger, P (1997) "The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E coli”, Cell 90:351-360 42 Rodney J.Y.HO, Milo Gibaldi ( 2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals, transforming proteins and genes into drugs, Wiley- liss, p 271- 311 43 Skerra A, Pluăckthun A (1988), Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli”, Science 240:1038–41 44 Soderlind E; Simonsson; Borrebaeck (1992), “Phage display technology in antibody engineering: design of phagemid vectors and in vitro maturation systems”, Immunol Rev 130, 109 45 Tordsson JM, Ohlsson LG, Abrahmsen LB, Karlstrom PJ, Lando PA, Brodin TN (2000), “Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of malignant melanoma”, Cancer Immunol Immunother 48:691–702 46 Urban, Schneider, Compte, M., Finger, C., Cichutek, K., et al (2005), “Selection of functional human antibodies from retroviral display libraries” J Nucleic Acids Res 33:e35 47 Vaughan, Williams ; Pritchard, K.; Osbourn, J.K.; Pope, A.R.; Earnshaw, J.C.; McCafferty, J.; Hodits, R.A.; Wilton, J.; Johnson, K.S (1996), “Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library”, Nature Biotechnol 14 48 Watters, Telleman, P., Junghans, (1997), “An optimised method for cell based phage display panning”, Immunotechnology 3:21-29 49 Wezenbeek, Hulsebos, Schoenmakers, (1980), “Nucleotide sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome: comparison with phage fd”, Gene 11:129-148 50 Willats, Wurrel G (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Mol Biol 50:837-854 51 Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, Hoogenboom HR (1994), “Making antibodies by phage display technology”, Annu Rev Immunol 12:433–55 52 Zhigang Zhao and Guohua Zeng (2010), “increased serum level of early prosate cancer antigen is associated with subsequent cancer risk in men with high-grade prostatic intraepithelial neoplasia” 17: 505-512  ... gen mã hóa kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA bệnh ung thư tuyến tiền liệt  Đã thu nhận kháng thể tái tổ hợp phage-scFv gắn đặc hiệu với kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA kỹ thu? ??t.. .nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA công nghệ gen. ” CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1 Giới thiệu chung tuyến. .. nhân gen mã hóa mảnh kháng thể scFv PCR Để thu gen mã hóa mảnh kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên EPCA bệnh ung thư tiền liệt tuyến đủ cho việc thiết kế vector biểu hiện, thực phản ứng nhân gen