Đa dạng di truyền 5 quần thể gà nội

29 382 0
Đa dạng di truyền 5 quần thể gà nội

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ng di truyn 5 qun th ni Lê Quang Nam i hc Khoa hc T nhiên Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30 ng dn: PGS.TS Nguy o v: 2012 Abstract: Nghiên cu ngun gc và phân loi nhà; các k thut sinh hc phân t c s dng trong nghiên cng di truyn 5 qun th nm di truyn qun th. Nghiên cu 60 cá th Tri và 59 cá th Tiên Yên; 54 cá th  Hà Nam, Hà Ni và Thái Bình; các k thut thc nghim; phân tích thng kê. Trình bày kt qu    n; kt qu   m di truyn. Keywords: Sinh hc thc nghim; ng di truyn; Content Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc và phân loại nhà  [11]. có   -[2]. N               [2]. 1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 1.2.1 PCR PCR là mc phát trin bi Kary Mullis trong nhn ng PCR ch i mu rt nh. Trong - 2 - ng hng vt có vú, 1.0 μg ADN là ti phn ng, có cha xp x 3x10 5 bn sao ca mi vi nm men, vi khung ADN tc s dng cho mi phn ng là 10 ng, 1 ng và 1 pg [35]. 1.2.2 Kỹ thuật microsatellite Microsatellite là loi ADN lp lc to thành t n lp dài t n 8 nucleotide 1 . Chúng có th  ng là các ch th phân t trong nghiên cu di truyn qun th. Các microsatellite có th tìm thy m gen, c vùng mã hoá và không mã hoá [41]. Cc s d lp b và nghiên cng di truyn trên ngay t thc ng dng là do trình t c , phân b ri rác toàn b h gen [37], và rt nhiu locus microsatellite nghiên cu trên g c công b và lp b [12], [21]. Thông tin v các microsatellite có th d dàng nhn       http://www.thearkdb.org/arkdb/, http://aviandiv.tzv.fal.de/primer_table.html 1.2.3 Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật microsatellite Mc T chp Quc - FAO dùng làm công c phân t u tiên cho d án MoDAD (Measurement of Domestic Animal Diversity) nh giá s ng di truyn ca ng vt ba. Hin nay các microsatellite là công c tt nht cho vic nghiên cn tính trng s ng và cho vi  dng di truyn ca các qun th vt nuôi. Kt qu nghiên cu các ging n a Trung Quc cho thy khi phân tích bng microsatellite thì tần số dị hợp tử quan sát c là cao nht (75.91%), ti  pháp RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (26.32%), cu  pháp phân tích allozyme (22.09%) [44]. Dùng microsatellite khi nghiên cu trên qun th có th t locus và tn s d hp t có th n 90% [40]. Khi s dng 14 locus microsatellite  phân tích mi quan h di truyn gia các qun th ba khác nhau (ch yu t c và Ucraina vi tng s 224 cá th ca 20 qun th) và vi rng, vic lp cây quan hệ di truyền c tic 3 nhóm chính [32]. 42 ch th microsatellite c s dng  phân tích 23 dòng cao sn ca các ging Leghorn, 1 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html - 3 - rng, Fayoumi và Tây Ban Nha tc khoảng cách di truyền gia rng vi các dòng khác [45]. 22 ch th microsatellite c s dng  nh tn s d hp t và khoảng cách di truyền ca các ging gà: Châu Phi, Châu Á và Nam M. Kt qu cho thy các ging có s ng khu vc. 29 locus microsatellite   ng di truyn c  , vi 36 cá th thu t 3 làng [13]. Nghiên c ra có s khác bit di truyn gia 3 nhóm theo kho  a lý, các qun th  u  trng thái cân bng Hardy - Weinberg và không b ng bi giao phi cn huyt. Vic nghiên cu qun th Hà t lun rng, trong s vng mt ca bt c cu trúc qun th nào trong phm vi tli chia s vốn gen chung vi các ging khác [8]. S ng ln alen chung gia Hà Giang và rt qu phân tích c xut rng dòng chn ra t rng ti Hà Giang [8]. Vic s dng 29 microsatellite khi nghiên cu 9 ging ni và 2 ging Trung Qunh rng các ging Vit nam to nên vốn gen khác vi các ging Trung Quc, các ging min Bc to nên mt vốn gen không có cu trúc [14]. S khác bit ca các ging Vic gia min Bc và Duyên hi ming bng Cu Long ch ra rng s phân nhóm các ging Vit nam có quan h ti s phân cách v a lý ca chúng [14]. 1.3 Các đặc điểm di truyền quần thể 1.3.1 Các đại lƣợng di truyền đặc trƣng cho các quần thể Độ phong phú alen  mi locus và mu, kí hiu là R s , và tng th các mu kí hiu là R t là m c lp c mu, do vy cho phép so sánh gia các mu có c khác nhau. Petit và cng s [30]  ra nguyên tc tính s ng d kin ca các alen trong mt phân mu 2n gen, da trên 2N c ly mu (N ≥ nN là s nh nht các cá th c lp kii vi mt locus trong mt mu. Các qun th trong thc t ng có s sai khác gia tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử mong đợi. Tần số dị hợp tử quan sát là t l s cá th d hc trong nghiên cu và tần số dị hợp tử mong đợic gi là độ đa dạng gen, ca mt locus c tính da trên tn s quan sát ca các alen thui gi nh qun th nghiên cu  trng thái cân bng Hardy - Weinberg. - 4 - Hệ số cận huyết (ký hiu là F is ) xét ti mt locus  mt cá th là xác xu 2 alen thu mt alen t tiên, ging ht nhau 2 . Giá tr F is tng th các locus  mi ging s c s d nh trng thái cân bng Hardy - Weinberg  mi ging. Định luật cân bằng Hardy - Weinberg c phát bi 3 : biến dị di truyền trong mt qun th s i t th h n th h khác nu không có các yu t gây ri. Khi vic giao phi là ngu nhiên trong mt qun th lng hp gây rnh lut d ng c tn s alen và kiu gen s  i bi chúng  trong trng thái cân bng. Các yu t gây ri bao gm đột biến, chọn lọc tự nhiên, giao phi không ngu nhiên, lạc dòng di truyền và dòng chảy gen. 1.3.2 Mối quan hệ di truyền giữa các quần thể Độ sai khác di truyền gia các qun th nh qua giá tr F st . Giá tr F st  [0; 1]. Khoảng cách di truyền (ký hiu là D S ) c  4 là m bit hóa di truyn gia 2 qun th,  ng cách so sánh tn s alen, hoc alen i vi các marker microsatellite gia các qun th. Cách tính giá tr D S theo công b ca Nei  [27] là phù hp nht cho nghiên cu này. Cây quan hệ di truyền là s biu din b th mi quan h tin hóa gia các sinh vt hoc các gen 5 . neighbor joining [34] c s dng r xây dng cây quan hệ di truyền t d liu khoảng cách di truyền. Pu gi nh t tin i nên không to ra cây có r. Mc tiêu cneighbor joining là ti thiu hóa chiu dài nhánh ca cây. Nu khoảng cách di truyền có sai s rt nh, thì vn nhn c cây quan hệ di truyền neighbor joining có tính nghiêm ngt, vng chc. 2 identical by descend: http://www.evolution-textbook.org/content/free/glossary/glossary.html 3 http://www.nature.com/scitable/definition/hardy-weinberg-equilibrium-122 4 http://www.nature.com/nrg/journal/v5/n1/glossary/nrg1247_glossary.html 5 http://www.nature.com/scitable/definition/phylogenetic-tree-25 - 5 - Bootstrap là s kin nht v  chính xác ca cây quan hệ di truyền. Bootstrap là my v tính chính xác ca cây quan hệ di truyền, và giá tr 70% ho cho bit xác sui thc t là trên 95% [22]. - 6 - Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cƣ ́ u và đi ̣ a điê ̉ m thu mẫu ng nghiên cu gm 60 cá th Tri và 59 cá th Tiên Yên ti Trung tâm Chuyn giao Tin b K thut Nông Lâm nghip Hi Ninh, th xã Móng Cái - Qung Ninh; 54 cá th Móng (xut x t tnh Hà Nam) và 42 cá th Tè (xut x t tnh Phú Th) c nuôi ti Trung tâm Nghiên cu Gia cm Thc Vi Nuôi Quc Gia, T Liêm, Hà ni; và 35 cá th Tò ly ti huyn Qunh Ph tnh Thái Bình.   c hn ch ti quan h huyt thng gia chúng. 2.1.1 Trới Theo Nguy  n [3], Tri (hình 1, 2) có các màu ng mình dài c chân cao, có con chu, có con chi cm. Mt s u, cn th hin thân hình ngc n a ging. T l nuôi sn cao 90-95%. Khi lu nh. Tui thành thc là 23 tun tut tr - 120 qu. T l tht cao, th 2.1.2 Móng Theo H Xuân Tùng và cng s [4], Móng (hình 3) trng  t thó, màu bc. C tru có mào n, chân vàng, m vàng, thân hình chc chn t n 20 tun tui t l nuôi sng ca Móng con trt 98%. Tui thành thc sinh dc trung bình ca Móng là 161 ngày, sng trt 83.6 qu. Khng trng bình quân ca Móng lúc 38 tun tui là 48 gam. T l trt 87.2%; t l n/trng có phôi khá thp, t 82.1%. 2.1.3 Tè (gà lùn) ng s [5], Tè (hình 4) có chân thp, chiu cao chân t 4- 5cm, da chân có màu vàng, bàn chân 4 ngón, chân không có lông. mái ng thành có t ho m xuy cánh và . Gn hu b t 30 - 140 ngày t l nuôi st 95.n sinh sn t l nuôi sng bình quân/tháng là 98.5%. - 7 - Gà Tè phát dc sm, trng bu gáy lúc 58 ngày tui. Tu tru lúc 132 ngày, sng trng thc trong 72 tun (52 tun sinh st 68 - 71 qu, có tính p bóng r     bình quân mi la t 15-17 trng lp. Khi ng trng cân ti tu  t 48.5gam, trng có v màu trng hng và chng trng ng Ri. 2.1.4 Tiên Yên Theo Nguy [3], Tiên Yên (hình 5, 6) có các  c ngn chân thp, chân có 4 ngón có vy sng. T l nuôi sn cao 90 - 95%. Kh nh. Tui thành thc là 21 - 22 tun tut trng / mái / - 125 qu. T l p n cao, t l tht cao, thcid amin. Chúng thích nghi tt vu kin khí hu ca  l nuôi sng   u cao trên 96%. 2.1.5 Tò Theo Trnh Quang Hip [1], Tò (hình 7, 8) ng thành có thân hình chc kho,  pha lng 2.2 - 3 kg/c bit các k , dc chân có 2 v nht, có 2 hàng vy xp song song. tr tía, chân cao, nng 4 - sm. c bit  k chân và vùng ti tía, dc chân có 2 v  y xp song song. Gà Tò thành thc sinh sn khá sm 148 ngày tui, tu t 30% vào tun tui 30.  mi ln 14 - 17 qut. Sng trng 120 - 140 qu l phôi trung bình t 91.08%, t l p n ca Tò (n/trng p) tht 67.c, cao, khi p d  trng và dm cht con khi mi n. ng, chn lc và nhân thun t c nhân thun thì sc sng càng cao, vi t l nuôi sn t 0 - 17 tun tui  t là 90.76%, 92.77%, 93.06% và 93.96% [1]. 2.2 Các kỹ thuật thực nghiệm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 2.2.1 Lâ ́ y mâ ̃ u ma ́ u , tách và đánh giá chất lƣợng ADN Ly mi cá th khong 1 ml máu t ch cánh bng loi kim và ng ly mu - 8 - chuyên dng, chuyn ngay mu máu sau khi ly vào tube eppendorf 1.5 ml có np kín cha 50 μl dung dch EDTA 0.5M, lc nh cho u sn mu vào hp l bo qun. c tách bng b c) tách ADN t máu. ADN tng s sau khi tách s n di trên gel agarose 1%    xác  tinh sch và n ca ADN, ta tính ch s OD ca ADN  c sóng 260 nm và 280 nm s gia hai ch s  T l A260/A280 là 1.8 - 2.0 phn ánh ADN   tinh khit. 2.2.2 PCR đa mồi và xác định kích thƣớc alen Nghiên cu này s dng 22 c ly t d án AVIANDIV 6 . Locus LEI0194 c s dng theo Mcconnell và cng s [23]. Thông tin chi tit v 23 locus microsatellite trong nghiên cu c th hin  bng 1. B kít Multiplex Master Mix PCR cc s d thc hin các phn i. Các mc gn màu hu và lc. Sn phm  c cnh c bng máy CEQ8000 ca hãng Beckman Coulter. Phn mm CEQ Genetic System s cho ra danh sách các alen ca tng locus  mi cá th.  1. Các   Locus NST Trình t mi (5' -> 3') xuôi ( trên), mc ( i) T o gn mi Mã GeneBank Khong alen MCW 0295 I 4 ATCACTACAGAACACCCTCTC 60 G32052 88-106 TATGTATGCACGCAGATATCC ADL 0112 I 10 GGCTTAAGCTGACCCATTAT 58 G01725 120-134 ATCTCAAATGTAATGCGTGC MCW 0216 I 13 GGGTTTTACAGGATGGGACG 60 AF030586 139-149 AGTTTCACTCCCAGGGCTCG MCW 0014 I 6 TATTGGCTCTAGGAACTGTC 58 L40040 164-182 GAAATGAAGGTAAGACTAGC MCW 0098 I 4 GGCTGCTTTGTGCTCTTCTCG 60 L40074 261-265 CGATGGTCGTAATTCTCACGT MCW 5 CCACACGGAGAGGAGAAGGTCT 60 L43686 135-147 6 http://aviandiv.tzv.fal.de/ - 9 - 0078 II TAGCATATGAGTGTACTGAGCTTC MCW 0111 II 1 GCTCCATGTGAAGTGGTTTA 60 L48909 96-120 ATGTCCACTTGTCAATGATG MCW 0222 II 3 GCAGTTACATTGAAATGATTCC 60 G31996 220-226 TTCTCAAAACACCTAGAAGAC LEI 0094 II 4 GATCTCACCAGTATGAGCTGC 60 X83246 247-287 TCTCACACTGTAACACAGTGC MCW 0183 II 7 ATCCCAGTGTCGAGTATCCGA 58 G31974 296-326 TGAGATTTACTGGAGCCTGCC ADL 0278 III 8 CCAGCAGTCTACCTTCCTAT 60 G01698 114-126 TGTCATCCAAGAACAGTGTG LEI 0194 III 1 TCCTTGGCATGTACATATGA 65-55 Z83779 ACTGCATGTTCTTTGATAGGC I, II, III  - 10 - Các   Locus NST Trình t mi (5' -> 3') xuôi ( trên), mc ( i) T o gn mi Mã GeneBank Khong alen MCW 0069 III 26 GCACTCGAGAAAACTTCCTGCG 60 L43684 158-176 ATTGCTTCAGCAAGCATGGGAGGA MCW 0034 III 2 TGCACGCACTTACATACTTAGAGA 60 L43674 212-246 TGTCCTTCCAATTACATTCATGGG MCW 0103 IV 3 AACTGCGTTGAGAGTGAATGC 64 G31956 266-270 TTTCCTAACTGGATGCTTCTG ADL 0268 IV 1 CTCCACCCCTCTCAGAACTA 60 G01688 102-116 CAACTTCCCATCTACCTACT MCW 0037 IV 3 ACCGGTGCCATCAATTACCTATTA 64 L43676 154-160 GAAAGCTCACATGACACTGCGAAA MCW 0067 IV 10 GCACTACTGTGTGCTGCAGTTT 60 G31945 176-186 GAGATGTAGTTGCCACATTCCGAC MCW 0206 V 2 ACATCTAGAATTGACTGTTCAC 60 AF030579 221-249 CTTGACAGTGATGCATTAAATG MCW 0248 V W29 GTTGTTCAAAAGAAGATGCATG 60 G32016 205-225 TTGCATTAACTGGGCACTTTC MCW 0081 V 5 GTTGCTGAGAGCCTGGTGCAG 60 L43636 112-135 CCTGTATGTGGAATTACTTCTC LEI 0166 V 3 CTCCTGCCCTTAGCTACGCA 60 X85531 354-370 TATCCCCTGGCTGGGAGTTT MCW 0330 V 17 TGGACCTCATCAGTCTGACAG 60 G32085 256-300 AATGTTCTCATAGAGTTCCTGC III, IV, V: kí hii Khong alen: ly theo d án AVIANDIV (http://aviandiv.tzv.fal.de/) 2.3 Phân tích thống kê D lic x lý bi các phn mm FSTAT v2.9.3 [20], Genetix v4.03 [46], Microsatellite Analyser (MSA) v4.05 [15], neighbor và consensus thuc gói phn mm Phylip v3.69 [18]; và phn mm Treeview v1.6.6 [29]. 2.3.1 Các đại lƣợng di truyền đặc trƣng cho các quần thể [...]... 0.221* *** NS NS NS LEI0166 0.4 75 0 .58 7 0.191 0.288 0.279 -0.034 0. 452 0 .50 6 0.107 0.627 0 .59 2 -0. 059 0.343 0.439 0.218NS *** *** NS NS MCW0330 0 .54 5 0. 657 0.169 0 .55 8 0. 755 0.262 0.619 0.667 0.072 0.6 95 0.6 95 0.000 0.7 65 0.682 -0.121NS Tổng số 0 .52 2 0 .59 7 0.1 25* ** 0.474 0 .55 1 0.139*** 0 .52 3 0 .57 2 0.086*** 0 .55 6 0 .58 1 0.042* 0.4 85 0 .55 5 0.126*** NS không tin cậy, *độ tin cậy 95% , ***độ tin cậy 99,9% khi... từng quần thể Quần thể Trới Quần thể Móng Quần thể Quần thể Tiên Yên Quần thể Tò Locus Heobs Heexp Fis Heobs Heexp Fis Heobs Heexp Fis Heobs Heexp Fis Heobs Heexp Fis NS *** *** NS MCW02 95 0.862 0.819 -0. 053 0 .56 6 0.730 0.2 25 0.619 0.7 95 0.221 0.864 0.814 -0.062 0.667 0.696 0.043NS ADL0112 0.379 0.490 0.2 25* ** 0. 352 0.402 0.124NS 0 .50 0 0.480 -0.042NS 0.492 0.4 45 -0.104NS 0.212 0. 359 ... thể Quần thể Trới Móng Tè - 14 - Tiên Yên Tò Tổng số 6.9 3.0 3.0 4.0 2.0 5. 0 2.0 3.0 6.6 6.0 4.0 3.0 4.4 5. 7 2.0 4.0 3.0 3.0 4.7 4.9 4.0 2.0 4.6 90.8 8 3 4 4 2 6 3 3 8 6 4 9 5 9 2 5 3 3 7 5 4 5 6 114 7 .5 2 .5 3.9 4.0 2.0 5. 9 2.7 3.0 6.7 5. 0 3 .5 7.4 5. 0 7.7 2.0 4.7 3.0 3.0 5. 8 4.4 4.0 4.2 5. 8 103.7 Rs Số alen 7 3 3 4 2 5 2 3 7 6 4 3 5 6 2 4 3 3 5 5 4 2 5 93 Rs Số alen MCW02 95 8 7.4 8... 0 .54 4 0.434*** 0 .57 6 0.627 0.082NS ADL0278 0.622 0.647 0.039NS 0.491 0 .58 5 0.162NS 0 .50 0 0.488 -0.024NS 0.702 0.666 -0. 053 NS 0.2 65 0.293 0.097NS LEI0194 0.404 0. 753 0.463*** 0.349 0.711 0 .51 0*** 0.207 0 .59 7 0. 654 *** 0.481 0.637 0.2 45* ** 0.242 0 .59 7 0 .59 4*** MCW0069 0 .51 7 0.670 0.228*** 0.481 0 .51 7 0.068NS 0 .54 8 0 .55 4 0.011NS 0.644 0. 657 0.019NS 0. 758 0.747 -0.015NS MCW0034 0.441 0 .57 6 0.2 35* ** 0 .59 3... Trới - Tiên Yên 0.00797** Nhỏ *** Trới - Tè 0.0 453 7 Nhỏ Trới - Móng 0. 054 31*** Trung bình *** Tè - Tiên Yên 0. 055 16 Trung bình Trới - Tò 0.06108*** Trung bình *** Móng - Tiên Yên 0.061 85 Trung bình Tè - Tò 0.07887*** Trung bình Tiên Yên - Tò 0.08031*** Trung bình *** Móng - Tò 0.08 454 Trung bình Móng - Tè 0.09441*** Trung bình ** *** , : độ... Tiên Yên Tần số Tần số 0.700 0.600 0 .50 0 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 Tò 140 142 0.900 0.800 0.700 0.600 0 .50 0 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 144 Trới Móng Tiên Yên Tò 291 2 95 297 Locus MCW0078 Trới Móng Tiên Yên Tò 220 Móng Tiên Yên Tò 111 117 Trới 0.400 Móng 0.300 Tè 0.200 Tiên Yên 0.100 Tò 0.000 273 279 283 Tần số Tần số 121... và Tiên Yên (DS = 0.012), giữa giống Trới và Tè (DS = 0.071) Mức độ biệt hóa di truyền giữa Trới với Móng (DS = 0.081) tương đương với mức độ biệt hóa di truyền giữa Tè và Tiên Yên (DS = 0.084) Mức độ biệt hóa di truyền giữa Trới và Tò (DS = 0.094) tương đương với mức độ biệt hóa di truyền giữa Móng và Tiên Yên (DS = (0.090) Mức độ biệt hóa di truyền giữa Tè và gà. .. 0.000 Trới Móng Tiên Yên Tò 1 25 Locus LEI0094 129 1 35 153 157 161 167 173 179 Locus LEI0194 Hình 11 Tần số alen thuộc locus LEI0094 Hình 14 Tần số alen thuộc locus LEI0194 - 18 - Trới Móng Tiên Yên Tần số Tần số 0.700 0.600 0 .50 0 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 Tò 153 161 1 65 167 169 0.800 0.700 0.600 0 .50 0 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 173 Trới Móng Tiên... 0.100 0.000 Trới Móng Tiên Yên Tò 103 163 173 Locus MCW02 95 0.900 0.800 0.700 0.600 0 .50 0 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 Hình 6 Tần số alen thuộc locus MCW0014 1.000 Trới Móng Tiên Yên Trới 0.800 Tần số Tần số 1 85 Locus MCW0014 Hình 3 Tần số alen thuộc locus MCW02 95 Móng 0.600 Tè 0.400 Tiên Yên 0.200 Tò 0.000 124 128 130 255 Locus ADL0112 257 Locus... quan sát ở 5 quần thể Tên locus Dải alen quan sát (số bp của các alen) MCW02 95 87-89-91- 95- 97-99-101-103 ADL0112 124-128-130 MCW0216 139-141-143-1 45 MCW0014 163-173-177-1 85 MCW0098 255 - 257 MCW0111 97-99-101-103-1 05- 111 MCW0078 140-142-144 MCW0222 218-220-224 LEI0094 249- 255 -261-263-2 65- 273-279-283 MCW0183 291-2 95- 297-303-3 05- 307-311-319 ADL0278 111-117-119 -121 LEI0194 1 25 -129 -1 35 - 153 - 157 -161-167-173-179 . Tò 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0 .50 0 0.600 1 15 151 153 155 Locus MCW0037 Tần số Gà Trới Gà Móng Gà Tè Gà Tiên Yên Gà Tò 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0 .50 0 0.600 173 1 75 179 Locus. 9 5 9 2 5 3 3 7 5 4 5 6 7 .5 2 .5 3.9 4.0 2.0 5. 9 2.7 3.0 6.7 5. 0 3 .5 7.4 5. 0 7.7 2.0 4.7 3.0 3.0 5. 8 4.4 4.0 4.2 5. 8

Ngày đăng: 10/02/2014, 14:53

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan