NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  TRẦN THỊ OANH Mã sinh viên: 1201452 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  TRẦN THỊ OANH Mã sinh viên: 1201452 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu, tìm hiểu thực đề tài với nhiều cố gắng, thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Với lòng biết sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đỗ Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo tơi thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược Bộ mơn Hóa Lý - trường Đại học Dược Hà Nội, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn em nhóm kiểm nghiệm mơn Hóa Dược ln động viên khích lệ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên Trần Thị Oanh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… Chương TỔNG QUAN……………………………………………………2 1.1 Terazosin 1.1.1 Một số thông tin chung terazosin 1.1.2 Chỉ định terazosin .2 1.1.3 Một số thành phẩm chứa terazosin thị trường 1.2 Tạp chất B terazosintheo USP 37 1.2.1 Một số thông tin chung tạp chất B terazosin 1.2.2 Quy định giới hạn tạp chất B terazosin nguyên liệu thành phẩm chứa terazosin 1.2.3 Phương pháp xác định tạp chất B trongnguyên liệu terazosin theo USP 37 1.3 Tổng quan số phương pháp hóa lý sử dụng nghiên cứu đề tài 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.3 Phương pháp đo phổ hồng ngoại 11 1.3.4 Phương pháp phân tích khối phổ 12 1.3.5 Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 12 1.3.6 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy .13 1.3.7 Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng .14 1.4 Các phương pháp tinh chế hợp chất hữu 14 1.4.1 Chiết 14 1.4.2 Sắc ký cột 15 1.4.3 Kết tinh 15 1.5 Các phương pháp tổng hợp dẫn chất phenol 16 1.5.1 Phương pháp 16 1.5.2 Phương pháp 16 1.5.3 Phương pháp 16 1.5.4 Phương pháp 17 1.5.5 Phương pháp 17 1.6 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giới 17 1.6.1 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 17 1.6.2 Tình hình nghiên cứu giới 18 Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………………… 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.2 Thiết bị 21 2.3 Nôi dung nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp tổng hợp tạp chất B 22 2.4.2 Phương pháp tinh chế sản phẩm thô .22 2.4.3 Khẳng định cấu trúc chất tổng hợp 23 2.4.4 Xác định giới hạn tạp chất 23 2.4.5 Xác định hàm lượng IBT 23 2.4.6 Xác định giới hạn tạp chất B nguyên liệu chứa terazosin .23 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………… 24 3.1 Tổng hợp tạp chất B terazosin 24 3.1.1 Nguyên tắc : 24 3.1.2 Quy trình tổng hợp chung: 24 3.1.3 Cách đánh giá để lựa chọn điều kiện phản ứng thích hợp 25 3.1.4 Khảo sát giai đoạn diazo hóa 25 3.1.5 Khảo sát giai đoạn thủy phân 29 3.1.6 Quy trình tổng hợp tạp chất B terazosin 32 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm thô .32 3.2.1 Đo nhiệt độ nóng chảy 32 3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm thô TLC .33 3.3 Tinh chế IBT thô 34 3.3.1 Chuẩn bị cột sắc ký 34 3.3.2 Đưa mẫu lên cột 34 3.3.3 Tiến hành rửa giải 34 3.4 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế 35 3.4.1 Đo nhiệt độ nóng chảy 35 3.5 Khẳng định cấu trúc sản phẩm tinh chế 37 3.5.1 Đo phổ IR 37 3.5.2 Phổ khối MS 38 3.5.3 Phổ NMR 38 3.5.4 Kết phân tích nhiệt trọng lượng .39 3.6 Xác định giới hạn tạp chất liên quan hàm lượng sản phẩm 40 3.6.1 Xác định tạp chất liên quan TLC 40 3.6.2 Xác định tạp chất liên quan HPLC 40 3.6.3 Bước đầu xác định hàm lượng hàm lượng IBT 43 3.7 Sử dụng sản phẩm để kiểm tra giới hạn tạp B nguyên liệu terazosintheo USP 37 45 3.7.1 Điều kiện sắc ký 45 3.7.2 Chuẩn bị dung dịch 45 Chương BÀN LUẬN…………………………………………………….49 4.1 Tổng hợp 49 4.2 Phân lập sản phẩm thô 49 4.3 Khảo sát hệ sắc ký đánh giá mức độ tạp chất sản phẩm thô hệ sắc ký tinh chế phương pháp sắc ký cột 49 4.4 Tinh chế 50 4.5 Đánh giá độ tinh khiết củaIBT TLC xác định nhiệt độ nóng chảy 50 4.6 Khẳng định cấu trúc IBT tinh chế 50 4.7 Về xác định giới hạn tạp chất liên quan hàm lượng IBT phương pháp HPLC 51 4.8 Về sử dụng sản phẩm tinh chế kiểm tra giới hạn tạp chất B nguyên liệu terazosin 52 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………53 5.1 KẾT LUẬN 53 5.2 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CRS (Chemical reference standard) : Chất chuẩn đối chiếu DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa HPLC (High-performance liquid : Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography) IBT (Impurity B of terazosin) : Tạp chất B terazosin IR (Infranred) : Hồng ngoại MS (Mass spectrum) : Phổ khối lượng NMR (Nulear magnetic resonance) : Cộng hưởng từ hạt nhân PA (Pure analysis) : Tinh khiết phân tích RSD (Relative standard deviation) : Độ lệch chuẩn tương đối TLC (Thin layer chromatography) : Sắc ký lớp mỏng TB : Trung bình USP (United States Pharmacopoeia) : Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số thành phẩm chứa terazosin thị trường Bảng 1.2 Dãy chất phenol thơm tổng hợptừ dẫn chất halogenid vòng thơm 19 Bảng 3.2 Hiệu suấtcủa phản ứng tổng hợp thay đổi tỷ lệ mol acid sulfuric 25 Bảng3.3 Hiệu suấtcủa phản ứng tổng hợp thay đổi tỷ lệ mol NaNO2 27 Bảng 3.4 Hiệu suất phản ứng tổng hợp thay đổi thời gian diazo hóa 28 Bảng 3.5 Hiệu suất phản ứng tổng hợp thay đổi nhiệt độ thủy phân 30 Bảng 3.6 Hiệu suất phản ứng tổng hợp khảo sát thời gian thủy phân 31 Bảng 3.7 Hiệu suấtcủa trình tổng hợp 32 Bảng 3.8 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm thô .33 Bảng 3.9 Hiệu suất tinh chế IBT thô tồn q trình tổng hợp tinh chế IBT 35 Bảng 3.10 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm tinh chế .36 Bảng 3.11 Kết phổ IR sản phẩm 37 Bảng 3.12 Kết phân tích phổ 1H-NMR sản phẩm 38 Bảng 3.13 Kết phân tích phổ 13C-NMR sản phẩm .39 Bảng 3.14 Kết phân tích nhiệt trọng lượng sản phẩm 40 Bảng 3.15 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký 41 Bảng 3.16 Giá trị thời gian lưu pic sắc ký 41 Bảng 3.17 Giá trị độ phân giải hai pic liền kề 42 Bảng 3.18 Diện tích pic tạp chất IBT 42 Bảng 3.19 Giới hạn tạp chất IBT .43 Bảng 3.20 Kết xác định hàm lượng IBT tinh chế .44 Bảng 3.21 Đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký 46 Bảng 3.22 Giá trị thời gian lưu pic sắc ký 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo terazosin Hình 1.2 Một vài biệt dược chứa terazosin Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo IBT Hình 3.1 Giai đoạn phản ứng tổng hợp IBTdự kiến 24 Hình 3.2 Giai đoạn phản ứng tổng hợp IBTdự kiến 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ phản ứng khảo sát tỷ lệ mol acid sulfuric 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ phản ứng khảo sát tỷ lệ mol natri nitrit .27 Hình 3.6 Sắc ký đồ phản ứng khảo sát thời gian diazo hóa .29 Hình 3.7 Sắc ký đồ phản ứng khảo sát nhiệt độ thủy phân 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ phản ứng khảo sát thời gian thủy phân 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ đánh giá sản phẩm thơ .33 Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát phân đoạn tinh chế IBT qua cột 35 Hình 3.11 Sắc ký đồ sản phẩm tinh khiết .37 Hình 3.12 Giản đồ nhiệt sản phẩm tinh chế .39 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng xác định hàm lượng IBT 43 Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch đối chiếukhi xác định hàm lượng IBT 44 Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch thửkhi xác định hàm lượng IBT 44 Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu trắng kiểm tra giới hạn tạp B nguyên liệu terazosin 46 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch đối chiếukhi kiểm tra giới hạn tạp B nguyên liệu terazosin .47 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu terazosinkhi kiểm tra giới hạn tạp B nguyên liệu terazosin .47 ĐẶT VẤN ĐỀ Phì đại lành tính tuyến tiền liệt bệnh thường gặp đàn ông trung niên Biện pháp phẫu thuật mở tuyến tiền liệt đóng vai trị quan trọng bệnh nhân có triệu chứng Tuy nhiên tỷ lệ phẫu thuật giảm kể từ thuốc chẹn kênh α-adrenergic thuốc ức chế 5α-reductase trở nên phổ biến để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt [35], [40] Một số nghiên cứu dịch tễ học đánh giá việc sử dụng thuốc chẹn kênh α-adrenergic điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt chứng minh thuốc chẹn kênh α-adrenergic có khả giảm nhiều chi phí liên quan đến phẫu thuật [31], [34] Thuốc chẹn kênh α-adrenergic terazosin hydroclorid sử dụng rộng rãi cho bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, đặc biệt người có kèm tăng huyết áp thuốc làm giảm co thắt trơn tuyến tiền liệt làm giảm huyết áp [33] Một yếu tố ảnh hưởng tới hiệu điều trị bệnh chất lượng nguyên liệu làm thuốc thành phẩm thuốc Khi kiểm tra chất lượng nguyên liệu thành phẩm chứa terazosin, dược điển Mỹ quy định giới hạn tạp chất B terazosin Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm nước ta gặp nhiều khó khăn cịn phụ thuộc vào nguồn tạp chất chuẩn nước với giá thành cao thời gian đặt hàng lâu Vì vậy, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp tạp chất B terazosin dùng kiểm nghiệm thuốc” với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp tổng hợp tinh chế tạp chất B terazosin quy mơ phịng thí nghiệm Xác định hàm ẩm, giới hạn tạp chất liên quan, bước đầu xác định hàm lượng sản phẩm sử dụng sản phẩm để xác định giới hạn tạp chất B nguyên liệu terazosin Chương TỔNG QUAN 1.1 Terazosin 1.1.1 Một số thông tin chung terazosin - Công thức phân tử: C19H25N5O4 - Phân tử lượng: 387,43 - Công thức cấu tạo: O N H3CO H3CO N N O N NH2 Hình 1.1.Cơng thức cấu tạo terazosin - Tên khoa học: (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2-ylcarbonyl)piperazin-1yl]quinazolin-4-amin - Tính chất: + Tinh thể màu trắng, khơng mùi, tan tốt methanol, nước, tan ethanol 96% cloroform, khơng tan aceton n-hexan + Có khả hấp thụ UV IR [42] 1.1.2 Chỉ định terazosin - Sử dụng đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa nhẹ người lớn Có thể sử dụng thuốc lợi tiểu, thuốc điều trị tăng huyết áp khác sử dụng độc lập phác đồ điều trị không hiệu không phù hợp Tác dụng hạ huyết áp hiệu huyết áp tâm trương - Sử dụng để giảm triệu chứng phì đại lành tính tuyến tiền liệt [30], [32], [36], [38], [39], [41] 1.1.3 Một số thành phẩm chứa terazosin thị trường Các thành phẩm chứa terazosin thị trường đa dạng hãng sản xuất, dạng bào chế, hàm lượng hoạt chất (bảng 1.1 hình 1.1) Bảng 1.1 Một số thành phẩm chứa terazosin thị trường STT Biệt dược Hàm lượng Hãng sản xuất Nước sản xuất Hytrin Abbott Ấn Độ Vicard-T mg Abbott Ấn Độ Teraz mg,2 mg, Unichem mg Laboratories Olyster Teradip mg Terakare mg Teralfa mg,5 mg Terapress mg Unoter mg, mg Pharmacia India Ấn Độ 10 Terazosin 10mg Apotex Mỹ 1mg, mg, mg mg, mg, Zydus Alidac 5mg Glenmark Pharmaceuticals Medley Pharmaceuticals Torrent Pharmaceuticals Intas Pharmaceuticals Hình 1.2 Một vài biệt dược chứa terazosin Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ 1.2 Tạp chất B terazosintheo USP 37 1.2.1 Một số thông tin chung tạp chất B terazosin - Công thức phân tử: C19H24N4O5 - Phân tử lượng: 388,42 - Công thức cấu tạo: O N H3CO N N O N H3CO OH Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo IBT - Tên khoa học: 1-(4-Hydroxy-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-[(tetrahydro-2furanyl)carbonyl]piperazin 1.2.2 Quy định giới hạn tạp chất B terazosin nguyên liệu thành phẩm chứa terazosin - Trong chuyên luận terazosin hydroclorid USP 37, giới hạn tạp chất B terazosin hydroclorid không 0,1% [42] - Trong chuyên luận viên nén terazosin USP 37, giới hạn tạp chất B viên nén terazosin không 0,2 % [42] 1.2.3 Phương pháp xác định tạp chất B nguyên liệu terazosin theo USP 37 - Pha động: hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 acetonitril (1685:315) - Dung dịch chuẩn gốc: Hịa tan lượng xác khoảng 100,0 mg terazosin chuẩn bình định mức 200 ml pha động, trộn - Dung dịch chuẩn gốc (1): Hòa tan lượng xác tạp chuẩn B terazosin methanol để nồng độ 0,5 mg/ml - Dung dịch chuẩn: Pha loãng ml dung dịch chuẩn gốc ml dung dịch chuẩn gốc(1) thành 100 ml hỗn hợp nước:acetonitril:methanol (60:30:10), trộn Pha loãng 10 ml dung dịch thành 100 ml pha động - Dung dịch thử: Hịa tan xác khoảng 125,0 mg chế phẩm 25,0 ml hỗn hợp nước:acetonitril (1:1) - Cột: L7 (25cm x 4,6 mm; μm) - Nhiệt độ phân tích: 30°C - Thể tích tiêm: 20 µl - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Detector: UV 254 nm - Thời gian chạy: 60 phút - Yêu cầu giới hạn tạp chất B: Không 0,1% [43] 1.3 Tổng quan số phương pháp hóa lý sử dụng nghiên cứu đề tài 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.3.1.1 Nguyên tắc Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất cho pha động di chuyển qua pha tĩnh mà chấm hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ lựa chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển lớp mỏng theo hướng pha độngvới tốc độ khác Kết thu sắc ký đồ lớp mỏng Cơ chế tách chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp đồng thời nhiều chế tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi làm pha động 1.3.1.2 Đại lượng đặc trưng - Hệ số lưu trữ Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích Trị số tính tỷ lệ khoảng cách di chuyển chất phân tích khoảng cách di chuyển pha động: 𝑅𝑓 = 𝑑𝑅 𝑑𝑀 Trong đó: dR khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích(cm) dM khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo đường vết, cm) Rf có giá trị dao động - Hệ số lưu trữ tương đối Rr: 𝑅𝑟 = 𝑑𝑅,𝑋 𝑑𝑅,𝐶 Trong đó: dR,X đường chất phân tích (cm) dR, C đường chất chuẩn (cm) Giá trị Rr gần chất phân tích chất chuẩn đồng 1.3.1.3 Ứng dụng - Định tính: Thường dựa vào trị số Rf mẫu thử mẫu chuẩn chạy sắc ký điều kiện - Thử tinh khiết: Mức độ tinh khiết hợp chất thể vết lạ sắc ký đồ - Định lượng: Có cách để định lượng chất vết sắc ký Một tách chiết chất phân tích vết sắc ký dung mơi thích hợp định lượng chất phân tích kỹ thuật thích hợp Hai định lượng trực tiếp mỏng [2], [3], [4] 1.3.1.4 Một số ví dụ xác định tạp chất khơng định danh TLC Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan viên nén ibuprofen [3] - Bản mỏng: silicagel GF254 - Dung môi khai triển: n-hexan:ethyl acetat:acid acetic khan (15:5:1) - Dung dịch thử: Chiết lượng bột viên tương ứng khoảng 0,250 g ibuprofen với cloroform, chiết lần, lần 10,0 ml cloroform, bay dịch chiết khoảng ml, thêm cloroform cho vừa đủ 5,0 ml - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml cloroform - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt ml dung dịch lên mỏng Sau triển khai xong sắc ký, lấy mỏng để khơ ngồi khơng khí phun dung dịch kali permanganat 1% acid sulfuric loãng, sấy mỏng nhiệt độ 120oC khoảng 20 phút Quan sát ánh sáng tử ngoại khả kiến bước sóng 365 nm Bất kỳ vết phụ xuất sắc ký đồ dung dịch thử không đậm màu vết dung dịch đối chiếu Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan nguyên liệu cloroquin phosphat [28] - Bản mỏng: silicagel GF254 - Dung dịch thử: Hịa tan xác khoảng 0,50 g mẫu thử nước, pha loãng thành 10,0 ml dung mơi hịa tan - Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử tới 100,0 ml với nước - Dung dịch đối chiếu (b): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (a) tới 10,0 ml với nước - Phát vết soi đèn UV 254 nm - Cách đánh giá kết quả: Bất kỳ vết sắc ký đồ dung dịch thử, vết chính, khơng đậm vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (a) (1,0%) không nhiều vết đậm vết sắc ký sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (b) (0,5%) 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.3.2.1 Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp sắc ký tách chất khỏi hỗn hợp phân tích pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn dạng tiểu phân chất lỏng hấp phụ chất mang rắn, hay chất mang liên kết hóa học với nhóm hữu Q trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion phân loại theo kích cỡ 1.3.2.2 Một số đại lượng đặc trưng trình sắc ký - Thời gian lưu tR: Là thời gian tính từ chất phân tích tiêm vào hệ thống sắc ký đến phát nồng độ đạt cực đại - Hệ số dung lượng k’: 𝑘 ′ = 𝑡𝑅′ 𝑡0 = 𝑡𝑅 −𝑡0 𝑡0 = 𝑡𝑅 𝑡0 − - Hệ số chọn lọc α: 𝛼= 𝑘′𝐵 𝑘′𝐴 = 𝑡𝑅,𝐵 −𝑡0 𝑡𝑅,𝐴 −𝑡0 (k’B> k’A) α khác nhiều khả tách rõ ràng Để tách riêng hai chất thường chọn α nằm khoảng 1,05 đến - Hiệu lực cột: Hiệu lực cột đánh giá thông qua số đĩa lý thuyết (N) chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký coi có N tầng lý thuyết, tầng phân bố chất tan vào hai pha đạt đến trạng thái cân Mỗi tầng giả định pha tĩnh có chiều cao H 𝑡 𝑁 = 16[ 𝑅]2 hay𝑁 = 5,54[ 𝑊 𝑡𝑅 𝑊1⁄ ]2 hay 𝐻 = 𝑁𝐿 Trong L chiều cao cột sắc ký W chiều rộng đáy pic W1/2là chiều rộng đo ½ chiều cao pic - Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối pic sắc ký đồ 𝐴𝐹 = 𝑊1/20 2𝑎 Trong đó: W1/20: Là chiều rộng pic đo 1/20 chiều cao pic a: Là khoảng cách từ đường vng góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước vị trí 1/20 chiều cao pic Trong phép định lượng yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ Giá trị AF gần pic cân đối - Độ phân giải : Đặc trưng cho mức độ tách chất khác điều kiện sắc ký Độ phân giải pic kề tính theo cơng thức : 𝑅𝑆 = 2(𝑡𝑅,𝐵 − 𝑡𝑅,𝐴 ) 1,18(𝑡𝑅,𝐵 − 𝑡𝑅,𝐴 ) √𝑁 𝛼 − 𝑘′𝐵 = = ( )( ) 𝑊𝐵 + 𝑊𝐴 𝑊1/2𝐵 + 𝑊1/2𝐴 𝛼 + 𝑘′𝐵 Trong đó: RS= 1,5 : Hai pic tách khỏi rõ ràng, xen phủ 0,3% RS= 1,0: Hai pic chưa tách hẳn xen phủ 0,4% RS= 0,75: Hai pic chưa tách 1.3.2.3 Ứng dụng - Định tính: Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic mẫu thử mẫu chuẩn, chồng phổ pic thử pic chuẩn để định tính chất thử - Định lượng: Dựa nguyên tắc nồng độ chất tỷ lệ với chiều cao diện tích pic Có phương pháp định lượng sử dụng : + Phương pháp chuẩn ngoại: Hai dung dịch mẫu chuẩn mẫu thửđược tiến hành sắc ký điều kiện Sau so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu từ mẫu thử với mẫu chuẩn biết nồng độ tính nồng độ chất có mẫu thử + Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử lượng biết chất chuẩn tương ứng với thành phần có mẫu thử tiến hành xử lý mẫu sắc ký điều kiện Nồng độ chưa biết mẫu thử tính dựa vào chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) tăng diện tích (hoặc chiều cao) pic + Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Dựa nguyên tắc hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc ký đồ - Xác định giới hạn tạp chất: Dựa nguyên tắc hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc ký đồ Do đó, tính giới hạn tạp chất mẫu thử giới hạn tổng tạp chất mẫu thử [3], [4], [6], [9], [18] 1.3.2.4 Một số ví dụ xác định tạp chất khơng định danh HPLC Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan viên nén tenoxicam [3] - Pha động: 0,12 g natri dodecyl sulfat 700,0 ml methanol, trộn với 100,00 ml dung dịch KH2PO4 0,05 M điều chỉnh đến pH 2,8 H3PO4 - Dung dịch (1): Lượng bột viên chứa khoảng 0,1 g tenoxicam 100,0 ml acetonitril 50 %, hút 5,0 ml dung dịch pha loãng thành 200 ml với pha động - Dung dịch (2): Pha loãng ml dung dịch (1) thành 200,0 ml với pha động - Điều kiện sắc ký + Cột: C8 (25 cm x mm; 10 µm) + Detector: UV 254 nm + Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Cách đánh giá kết quả: Trong sắc ký đồ dung dịch (1), khơng có pic phụ có diện tích lớn pic sắc ký đồ dung dịch (2) (0,5%) tổng diện tích pic phụ khơng lớn bốn lần diện tích pic sắc ký đồ dung dịch (2) (2%) Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan nguyên liệu niclosamid monohydrat [42] - Pha động: acetonitril:KH2PO4 g/l:Na2HPO4 g/l:tetrabutylamoni hydrosulfat g/l (1:1:1:1) - Dung dịch thử: Hịa tan xác khoảng 50,0 mg chế phẩm methanol, pha loãng tới 50,0 ml với methanol - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml acetonitril Pha loãng 1,0 ml dung dịch thành 20,0 ml với acetonitril - Điều kiện sắc ký: + Cột: 12,5 cm x mm; μm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 230 nm + Thời gian chạy: gấp hai lần thời gian lưu niclosamid - Cách đánh giá kết quả: 10