PHÁT HIỆN VI KHUẨN erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN cây địa LAN (cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR

1 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 Luận văn kỹ sư Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *** 000*** PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000*** PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN THỊ THANH HÀ KS DƯƠNG THÀNH LAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 Professor: Student: PhD NGUYEN LE DINH THI THANH DON HA BSc Term:2002 DUONG - 2006 THANH LAM LỜI CẢM TẠ • Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, nhận nhiều ủng hộ giúp đỡ từ gia đình, thầy bạn bè Nay xin chân thành cảm ơn đến: Cha mẹ người thân tạo điều kiện, động viên suốt trình học tập trường Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tất thầy cô tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường Thầy Lê Đình Đơn hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập tốt nghiệp Thầy Dương Thành Lam tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh chị làm việc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, anh chị làm việc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 động viên, giúp đỡ suốt thời gian học làm đề tài tốt nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Nguyễn Thị Thanh Hà TÓM TẮT KHÓA LUẬN • NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng năm 2006 “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR” Giáo viên hướng dẫn: Thầy Lê Đình Đơn Thầy Dương Thành Lam Địa điểm: Phịng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan (Cymbidium) Hiện nay, vườn địa lan thành phố Đà Lạt bị thiệt hại lớn bệnh thối làm chết gây Cho đến thời điểm người ta chưa xác định xác tác nhân gây bệnh chưa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu Do đó, việc tìm hiểu phương pháp chẩn đốn, phát tác nhân gây bệnh cần thiết giúp xây dựng quy trình phịng trừ bệnh hiệu Nội dung nghiên cứu bao gồm: Điều tra tình hình bệnh hại địa lan số vườn trồng địa lan địa bàn TP Đà Lạt - Lâm Đồng Phân lập mẫu vi khuẩn chủng bệnh lên củ khoai tây địa lan Nhân sinh khối dòng vi khuẩn phân lập Khuếch đại đoạn DNA nằm vùng 16S/23S rDNA vùng gen pel mã hóa pectate lyase vi khuẩn phương pháp PCR Kết đạt được: Tỷ lệ nhiễm bệnh vườn điều tra: - Bệnh vi khuẩn: 20,17% - Bệnh virus: 9,5% - Bệnh nấm: 11,6% Phân lập dịng vi khuẩn có màu khuẩn lạc đặc trưng: - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan: - Trên củ khoai tây: dịng vi khuẩn có khả gây bệnh mạnh sau 48 chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng) - Trên địa lan: hầu nhu dịng vi khuẩn khơng gây bệnh sau chủng bệnh 10 ngày (ở 250C), có dịng EC06-8 gây bệnh Khuếch đại đuợc đoạn DNA có kích thuớc 1,5 kb nằm vùng 16S/23S rDNA dòng vi khuẩn phân lập đuợc MỤC LỤC Phần Trang Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình .x Danh sách bảng xi PHẦN MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - yêu cầu .1 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên TP Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium 2.2 Giới thiệu lan Cymbidium 2.2.1 Phân loại - phân bố 2.2.2 Đặc điểm thực vật học .4 2.2.3 Yêu cầu sinh thái .5 2.2.4 Sâu bệnh 2.2.5 Tình hình sản xuất lan Cymbidium Tp Đà Lạt giới .7 2.3 Giới thiệu vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora tác hại .8 2.3.1 Phân loại 2.3.2 Erwinia carotovora 2.3.3 Erwinia carotovora subsp.carotovora .9 2.4 Phuơng pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn gây .13 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu thí nghiệm 17 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.1.2 Vật liệu 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu .18 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết địa lan TP Đà Lạt - Lâm Đồng 18 3.2.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 18 3.2.3 Quan sát vi khuẩn môi trường KB môi trường YDC 19 3.2.4 Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan .19 3.2.5 Tăng sinh khối vi khuẩn môi trường LB lỏng 21 3.2.6 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn .21 3.2.7 Thực phản ứng PCR .22 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Tình hình bệnh hại địa lan TP Đà Lạt - Lâm Đồng 25 4.1.1 Các triệu chứng bệnh địa lan 25 4.1.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, virus, nấm gây qua vườn điều tra 27 4.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 28 4.3 Quan sát vi khuẩn môi trường KB môi trường YDC 29 4.3.1 Trên môi trường KB 29 4.3.2 Trên môi trường YDC 30 4.4 Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan 31 4.4.1 Trên củ khoai tây 31 4.4.2 Trên địa lan 32 4.5 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 32 4.6 Phản ứng PCR 34 4.6.1 Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 34 Tác nhân gây bệnh Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, virus, nấm gây qua vườn điều tra Bệnh thối làm chết địa lan ảnh hưởng nghiêm trọng gây thiệt hại lớn cho người trồng lan Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn gây cao hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh nấm virus gây qua vườn điều tra (bảng 4.1 đồ thị 4.1), có vườn khơng bị nhiễm bệnh bị nhiễm bệnh hai tác nhân gây Như thế, khơng thể kết luận vườn hồn tồn bệnh mà bị bệnh tiềm ẩn, chưa biểu triệu chứng bên ngồi Điều nhiều ngun nhân góp phần làm cho bệnh lây lan phát triển mạnh Ngồi yếu tố tự nhiên kỹ thuật trồng chăm sóc nơng dân ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chưa có quy trình kỹ thuật hợp lý 4.2 Phân lập mẫu vi khuẩn Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra vấn vườn địa lan có bệnh chết xuất vườn khơng có bệnh, cho thấy nhận thức chủ vườn bệnh Phần lớn chủ vườn nhận biết triệu chứng bệnh điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, đa số hộ trồng chưa phân biệt bệnh có triệu chứng nguyên nhân gây Kết điều tra cho thấy, bệnh vi khuẩn gây chiếm tỉ lệ cao Truớc tình hình đó, chúng tơi tiến hành thu thập mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh vi khuẩn gây tiến hành phân lập Kết phân lập đuợc dịng vi khuẩn có màu khuẩn lạc đặc trung mơi truờng PGA (Hình 4.4): a Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn b Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn Erwinia carotovora subsp carotovora vi khuẩn gram âm Cho nên tiến hành kiểm tra gram âm, gram duơng để loại bỏ dòng vi khuẩn gram duơng cách sử dụng KOH 3% Tuy nhiên, cách kiểm tra không cho kết thật xác Có thể bị nhầm lẫn gram âm gram duơng vi khuẩn có thời gian ni lâu, tạo nhớt huyền phù KOH (a) (b) Hình 4.4 Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh mơi trường PGA a Khuẩn lạc màu vàng trứng, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn b Khuẩn lạc màu trắng đục, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn 4.3 Quan sát vi khuẩn mơi trường KB môi trường YDC 4.3.1 Trên môi trường KB Môi truờng KB đuợc dùng để xem phát sáng vi khuẩn chiếu duới tia UV Theo Fiori Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora khơng phát sáng mơi truờng KB Do đó, chúng tơi chọn lọc đuợc dịng khơng phát sáng để phục vụ cho nghiên cứu (Hình 4.5.1) 4.3.2 Trên môi trường YDC Theo Seo ctv (2001), thử nghiệm sinh lý, sinh hóa 87 dịng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora thấy 22 dịng Thái Lan có dịng sản sinh sắc tố vàng mơi trường YDC, 23 dịng Hàn Quốc 24 dịng Nhật Bản khơng sản sinh sắc tố vàng môi trường YDC Như vậy, dịng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora có đa dạng đặc tính kiểu hình phenotyp, chúng có phổ ký chủ phân bố địa lý rộng Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trường YDC để xem sản sinh sắc tố vàng hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Sau 24 quan sát thấy môi trường YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu đặc trưng (Hình 4.5.2) - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn a Khuẩn lạc vi khuẩn phát sáng chiếu tia UV, tạo thành quầng sáng xung quanh b Khuẩn lạc vi khuẩn khơng phát sáng chiếu tia UV Hình 4.5.1 Khuẩn lạc vi khuẩn môi trường KB chiếu tia UV sau 24 nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) a.Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn b Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn Hình 4.5.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn môi trường YDC sau 24 ni cấy (ở nhiệt độ phịng) 4.4 Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, địa lan Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trường YDC, tiến hành chủng lên củ khoai tây địa lan 4.4.1 Trên củ khoai tây: sau 48 chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu sau: (a) (c) (b) (d) Hình 4.6.1 Các triệu chứng bệnh củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 (ở nhiệt độ phòng) a Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày b Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày c Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng d Vết bệnh lõm xuống, nhày, xung quanh vết bệnh có đường viền màu nâu nhạt Sau 48 chủng vi khuẩn, quan sát thấy dịng vi khuẩn có khả gây hại mạnh: EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 EC06-19 với triệu chứng hình 4.6.1 Ngồi ra, dịng cịn lại khả gây bệnh yếu khơng gây bệnh Điều phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính vi khuẩn bị giảm 4.4.2 Trên địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhu dòng vi khuẩn không gây bệnh địa lan Chỉ có dịng EC06-8 gây bệnh vết bệnh có màu vàng xanh, lan theo chiều rộng phiến Ranh giới mơ bệnh mơ khỏe có viền màu nâu đen (Hình 4.6.2) a Ranh giới mơ bệnh mơ khỏe có màu nâu đen b Vùng bị bệnh có màu vàng xanh Hình 4.6.2 Triệu chứng bệnh địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C) Sau đó, chúng tơi tiến hành phân lập lại từ địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu bệnh Kết thu nhận đuợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (Hình 4.6.3) Hình 4.6.3 Vi khuẩn phân lập từ địa lan bị bệnh sau chủng vi khuẩn 10 ngày mơi trường PGA 4.5 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn DNA vật chất nghiên cứu di truyền phân tử Do đó, phải ly trích đuợc DNA tách khỏi tế bào chất nhu RNA, protein, Có nhiều phuơng pháp ly trích DNA mục đích cuối thu lượng DNA đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Tuy giai đoạn tách chiết DNA giai đoạn đơn giản lại đóng vai trị vô quan trọng Chúng tiến hành ly trích số dịng vi khuẩn Sau ly trích xong, tiến hành điện di kiểm tra DNA Kết ly trích thể hình 4.6 DNA tổng số Phần tạp nhiễm Hình 4.7 Sản phẩm ly trích DNA tổng số vi khuẩn EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10 Điện di gel agarose 0,8% hiệu điện 100V/15 phút dung dịch đệm TAE 0,5X, pl mẫu/giếng Qua hình cho thấy mẫu ly trích có độ tinh chưa cao Ngồi DNA tổng số cịn có phần tạp (RNA protein) phía Có thể loại bỏ phần tạp cách sử dụng enzyme RNAse Có số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài Tuy nhiên, DNA thu tương đối để thực phản ứng PCR Trước tiến hành thực phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành pha lỗng DNA gốc nước cất vô trùng TE 1X Do lượng DNA mẫu dùng phản ứng PCR khoảng từ 10 - 100 ng Nếu lượng DNA mẫu cao tạo sản phẩm phụ không mong muốn Sau pha lỗng, chúng tơi tiến hành điện di gel agarose để kiểm tra 4.6 Phản ứng PCR 4.6.1 Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 Chúng tiến hành chạy PCR dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC066, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer Xan 1330 Xan 322 Sản phẩm PCR Hình 4.8 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 56 0C) EC06-1, EC06-8, EC06-9, EC06-19 Điện di gel agarose 1% hiệu điện 50V/40 phút dung dịch đệm TAE 0,5X, 4pl mẫu/giếng Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose cho thấy thu sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb Tuy nhiên thấy xuất band điều chứng tỏ có tạp nhiễm Lý tạp nhiễm giải thích tạp nhiễm ly trích tạp nhiễm ni cấy phịng thí nghiệm Để khắc phục tượng này, nâng nhiệt độ bắt cặp từ 56 0C lên 580C Kết thu band Hình 4.9 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C) Sản phẩm PCR EC06-8 Điện di gel agarose 1% hiệu điện 50V/40 phút dung dịch đệm TAE 0,5X, 4pl mẫu/giếng Trình tự 16S rDNA mơ hình phổ biến để nghiên cứu tiến hóa , phân loại vi khuẩn xác định cho nhiều lồi vi khuẩn Trình tự 16S rDNA vùng hoạt động 16S - 23S rDNA biến đổi dòng loài Dựa vào vùng để phát khác lồi vi khuẩn.Cặp primer chúng tơi sử dụng thiết kế vùng 16S/23S rDNA, cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 1,5 kb Khi kiểm tra Genbank thấy cặp primer khuếch đại số lồi khác Như thế, chưa thể khẳng định vi khuẩn chúng tơi nghiên cứu xác Erwinia carotovora subsp carotovora Do đó, chúng tơi tiến hành thực phản ứng PCR với cặp primer Erw1 Erw2 4.6.2 Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 Erw2 Primer Y1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'), Y2 (5CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3) sử dụng để khuếch đại đoạn DNA có kích thước 434bp Trình tự mồi kiểm tra Genbank EBML (Darrasse ctv, 1994) Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng cặp primer có trình tự giống mơ tả Darrasse ctv (1994) có tên khác Erw1 Erw2 Chúng tiến hành thực phản ứng PCR với cặp primer Erw1 Erw2 với chu kỳ nhiệt nêu mục 3.2.7 Kết điện di gel agarose cho thấy khơng có sản phẩm khuếch đại tạo Điều chứng tỏ phản ứng PCR khơng xảy (Hình 4.10) Hình 4.10 Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 Erw2 Điện di gel agarose 1% hiệu điện 50V/40 phút dung dịch đệm TAE 0,5X, pl/giếng Theo chúng tơi có nhiều nguyên nhân khiến cho phản ứng PCR không xảy ra: - Nhiệt độ nóng chảy (melting) hai primer tuơng đối cao (84,9 0C 73,70C) thành phần có nhiều GC (66% 50%) Quy trình ban đầu thực nhiệt độ giai đoạn bắt cặp 65 0C nhu tuơng đối cao Nhung kết khơng có sản phẩm khuếch đại Do đó, chúng tơi tiến hành giảm xuống 62 0C, 600C, 580C nhung khơng có kết - Ngun nhân thứ hai nồng độ chất tham gia phản ứng thấp nên không đủ cho phản ứng PCR xảy Luợng Taq ban đầu sử dụng 0,1pl/UI, thấp khơng đủ để xúc tác cho phản ứng xảy Chúng tiến hành tăng luợng Taq từ 0,1pl/UI lên 0,2pl/UI đồng thời tăng nồng độ primer từ 10 pmol lên 20 pmol Nồng độ Mg2+ nhân tố ảnh huởng mạnh đến trình PCR Mg2+ cần cho trình liên kết dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm DNA mạch kép Nồng độ Mg2+ thấp làm hạn chế trình kéo dài Nguợc lại, nồng độ Mg 2+ cao giúp ổn định dây đôi DNA ngăn ngừa biến tính hồn tồn (do mở dây đơi DNA) sản phẩm chu kỳ (Hồ Huỳnh Thùy Duơng, 1998) Khoảng nồng độ cho phép Mg2+ từ - mM (McPherson, M J M0ller, S G 2000) Từ đó, chúng tơi tiến hành tăng nồng Mg2+ từ 1,5 mM lên mM, 2,5 mM, mM nhung không cho kết Nhu vậy, việc tăng nồng độ hóa chất khơng hiệu - Nguyên nhân thứ ba số chu kỳ khuếch đại sử dụng ban đầu (35 chu kỳ) tuơng đối dài Vì vậy, giảm từ 35 xuống 30 chu kỳ, 25 chu kỳ nhung khơng có sản phẩm khuếch đại đuợc tạo Qua thí nghiệm thay đổi điều kiện phản ứng PCR, kết khơng có sản phẩm khuếch đại tạo Có nhiều lý để giải thích cho vấn đề Thứ nhất, mẫu địa lan bị thối có nhiều loại vi sinh vật khác cơng mẫu vi khuẩn chúng tơi phân lập khơng có diện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora Thứ hai có tạp nhiễm phân lập ni cấy phịng thí nghiệm Thứ ba điều kiện phản ứng thay đổi chua phù hợp Do hạn chế mặt thời gian nên chúng tơi chua tìm đuợc quy trình PCR thích hợp cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bệnh thối làm chết địa lan ảnh hưởng nghiêm trọng đến vườn lan TP Đà Lạt - Lâm Đồng Qua kết điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn gây cao hẳn (20,17%) so với tỉ lệ nhiễm bệnh virus (9,5%) nấm (11,6%) Kết phân lập vi khuẩn thu dịng vi khuẩn có màu khuẩn lạc đặc trưng: - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng trứng, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn Kết chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan: - Trên củ khoai tây: dòng vi khuẩn có khả gây bệnh mạnh, dịng cịn lại khả gây bệnh yếu khơng gây bệnh - Trên địa lan : dịng vi khuẩn khơng gây bệnh sau chủng bệnh 10 ngày, có dịng EC06-8 gây bệnh Quy trình tách chiết DNA đơn giản, đảm bảo lượng DNA thu có độ tinh cao phục vụ tốt cho việc chạy PCR Quy trình thực mục 3.2.6 Kết phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 khuếch đại đoạn DNA có kích thước khoảng 1,5 kb 5.2 Đề nghị Từ khó khăn, trở ngại gặp phải trình nghiên cứu nên chúng tơi đưa số đề nghị sau: Cần có nghiên cứu cụ thể đặc điểm sinh trưởng phát triển, tiến hành thử phản ứng sinh hóa Bởi vì, nguồn mẫu ban đầu quan trọng, phải khẳng định chắn trước tiến hành thử nghiệm mức độ phân tử Cần có mẫu đối chứng dương điều quan trọng cần thiết Thiết lập lại quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan (Cymbidium) hồn thiện quy trình TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Văn Bảo, 1999 Kỹ thuật nuôi trồng phong lan Nhà xuất trẻ 175 trang Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử (Khái niệm - Phương pháp - Ứng dụng) Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Văn Minh, 2005 Điều tra bệnh chết kỹ thuật trồng địa lan (Cymbidium) TP Đà Lạt - Lâm Đồng Luận văn tốt nghiệp Ngành Nông Học 2005 Lê Hữu Quang, 2005 Nghiên cứu số loại giá thể cho hoa địa lan (Cymbidium) trồng TP Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học 2005 Lê Lương Tề Vũ Triệu Mân, 1999 Bệnh vi khuẩn virus hại trồng Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Trang - 118 Nguyễn Văn Tới, 2003 Một số vấn đề bảo vệ thực vật nuôi trồng hoa địa lan Cymbidium http://www.lamdong.gov.vn/rauhoadl/DesktopDefault.aspx?tabid=64 Trương Trỗ, 1988 Đà Lạt Cymbidium Sở khoa học, công nghệ môi trường Lâm Đồng.http://www.lamdong.gov.vn/cdrom/Dulich/Dacsan/Cymbidium/Images/cymbidium jpg&imgrefurl= TIẾNG NƯỚC NGOÀI Aysan Y., Saygili H., Sahin F and Mirik M New symptoms of tomato soft rot diseases in Turkey.http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695 32.htm Aysan Y., Saygili H., Sahin F and Cetinkaya-Yildiz R Present status of bacterial stem rot on tomato in Turkey http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695 10.htm 10 Cerkaukas R F and Brown J 2001 Bacterial stem and peduncle canker of greenhouse pepper http://ginkgo.cisti.nrc.ca/ppv/RPViewDoc?handler=HandleInitialGet&journal=tcjpp&v olume=23&articleFile=k01-019.pdf 11 Christopher P K and David H P 1999 Ribosomal DNA Sequencing as a tool for identiíication of bacterial pathogens Current Opinion in Microbiology, 2: 299 - 305 12 Darrasse A., Priou S., Kotojansky A and Bertheau Y 1994 PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gen as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases Applied and Environmental Microbiology, May, p.1437 1443 13 Fiori M and Schiaffino A., 2003 Bacterial Stem Rot in Greenhouse Pepper (Capsicum annuum L ): Occurrence of Erwinia carotovora sbsp carotovora J.Phytopathology 152, 28 - 33 14 Heidi Hyytiainen, 2005 Regulatory networks controlling virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora ssp carotovora Department of Biological and Environmental Sciences Faculty of Biosciences University of Helsinki.57 pages http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/bio/bioja/vk/hyytiainen/regulato.pdf 15 Kang H W., Kwon S W and Go S J 2003 PCR - based specific and sensitive detection of Pectobacterium ssp carotovorum by primers generated from a URP - PCR fingerprinting - derived polymorphic band Plant pathology 52, 127 - 133 16 Khoodoo M H R., Sahin F., Donmez M F and Jaufeerally Fakim Y 2004 Molecular characterisation of Xanthomonas Strains isolated from aroids in Mauritius Systematic and Applied Microbiology 28, 366 - 380 17 Marcos Montesano, 2002 Molecular characterization of plant defense respones to Erwinia carotovora Division of Genetics, Department of Biosciences, Faculty of Science University of Helsinki 60 pages http://ethesis.helsinki.fL/juikaisut/mat/bioti/vk/montesano/molecula.pdf 18 McPherson M J and M0ller S G., 2000 PCR BIOS 276 pages 19 Phokum C., Jitareerat P., Photchanachai S and Cheevadhanarak S Detection and classification of soft rot Erwinia of vegetables in Thailand by DNA polymerase chain reaction http://www.actahort.org/books/712/712-121.htm 20 Seo S T., Furuya N., Lim C K., Takanami Y and Tsuchiya K 2003 Phenotypic and genetic characterization of Erwinia carotovora from mulberry (Morus spp ) Plant Pathology p 142 21 Seo S T., Furuya N., Lim C K., Takanami Y and Tsuchiya K 2001 Phenotypic and Genetic Diversity of Erwinia carotovora ssp carotovora Strains from Asia J.Phytopathology.150: 120 - 127 22 Subandiyah S., Iwanami T., Tsuyumu S and leki H 2000 Comparison of 16S rDNA and 16S/23S Intergenic Region Sequences Among Citrus Greening Organisms in Asia Plant Dis 84:15 - 18 23 So Young Yoo, Sun Young Park, Won Min Yoo, Kyung Hee Chang, Nae Choon Yoo, June Myung Kim, Seung Min Yoo, Ki Chang Keum and Sang Yup Lee, 2002 Design of ITS and 23S rDNA - Targeted Probes and Its Usefulness for the Identification of Bacterial Pathogen Genome Informatics 13: 589 - 590 24 Wright P J 1998 Plant disease record A soft rot of calla (Zantedeschia spp ) caused by Erwinia carotovora subspecies carotovora http://www.rsnz.org/publish/nzjchs/1998/42.php 25 Yeshitila Degefu, Sanna Jokela, Erkki-Joki Tkola and Elina Virtanen, 2006 DNA based detection of blackleg and soft rot disease causing Erwinia strains in seed potatoes http://www.smts.fi/pos06/1008.pdf TRANG WEB http://vi.wikipedia.org/wiki/Hoa phong lan http://en.wikipedia.org/wiki/Erwinia http://www.soc.nii.ac.jp/jssm/Erwinia%20carotovora.jpg http://www.mientrung com/content/view/2457/39 ... NGHỆ SINH HỌC *** 000*** PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR Giáo vi? ?n hướng dẫn: Sinh vi? ?n thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN... Minh.Tháng năm 2006 “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR? ?? Giáo vi? ?n hướng dẫn: Thầy Lê Đình Đơn Thầy Dương Thành Lam Địa điểm: Phịng... nêu trên, tiến hành đề tài ? ?Phát vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan (Cymbidium) phương pháp PCR? ?? 1.2 Mục đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia