Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này được thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTPs 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Xan 1330 100 pmol/pl 10 pmol/pl Xan 322 100 pmol/pl 10 pmol/pl Taq DNA polymerase 5
UI/Lil 1UI
DNA mẫu 10 - 100 ng
H2O cất vừa đủ 25 Lil
Chu kỳ nhiệt
Các bước của phản ứng Nhiệt độ Thời
gian
Giai đoạn khởi động 940C 4 phút
Chạy chu kỳ (30 chu kỳ)
- Biến tính 940C 1 phút
- Bắt cặp 560C 45 giây
Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C
Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Sử dụng cặp primer có các thông số như sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG-<T>- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-<T>- 3'). Hai primer này được thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 434 bp (Darrasse và ctv, 1994).
Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTPs 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Erw1 75 pmol/pl 10 pmol/pl
Erw2 83 pmol/pl 10 pmol/pl
Taq DNA polymerase 5 UI/pl 1UI
H2O cất vừa đủ 25 pl
Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của
phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của
Seo và ctv, 2001.
Các bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 950C 5 phút
Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
- Biến tính 940C 30 giây
- Bắt cặp 650C 30 giây
- Kéo dài 720C 45 giây
Giai đoạn kết thúc Giữ ở 40C
720C 10 phút
Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện
trình làm để thu được kết quả tốt
của phản ứng
Điện di và đọc kết quả PCR
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel như sau: cân 0,125g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 6O0C (đến khi nào cầm được mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lược ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 pl sản phẩm PCR và 2 pl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 - 50 phút với cường độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V.
Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 - 20 phút.
Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, được quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN