3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chêt cây địa lan tại TP. Đà Lạt - Lâm Đồng
Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số hộ trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt từ đó xác định được tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi, trò chuyện với từng hộ sản xuất.
3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Mẫu bệnh được thu thập tại các vườn địa lan bị bệnh tại thành phố Đà Lạt. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trường PGA.
Cách phân lập mẫu: mẫu bệnh được phân lập từ vết bệnh điển hình. Cắt lấy mảnh nhỏ có kích thước 3 - 5 mm X 3 - 5 mm tại vị trí giữa mô bệnh và mô khỏe. Rửa mẫu bằng nước cất 2 - 3 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó
Các thiêt bị, dụng cụ thường sử dụng Các thiêt bị
Máy Vortex Lò Viba
Máy điện di (Bio-Rad)
Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Máy ly tâm (Sigma)
Máy PCR (Thermus cycle) (Eppendoft)
Các hóa chất sử dụng Hóa chất để ly trích DNA TE 1X SDS 10% NaCl CTAB/NaCl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Isopropanol Ethanol 70% Dụng cụ Ống nghiệm Micropipette các loại Đầu típ các loại Eppendoft 0,2 ml, 1,5 ml Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR 10X buffer PCR (Bio-Rad) MgCl2 50 mM (Bio-Rad) dNTP's mix 25 mM (Bio-Rad)
Primer Xan1330, Xan322 và Erw1, Erw2 Taq DNA polymerase
rửa lại bằng nước cất 2 - 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ
cấy. Chú ý không
nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên môi trường PGA, để ở nhiệt độ
phòng. Khi vi
khuẩn mọc cấy chuyền sang đĩa khác để tạo dòng thuần.
Cách đặt tên mẫu: EC06 - 1 là mẫu vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh trên cây địa lan tại Đà Lạt năm 2006, mẫu 1. (E: Erwinia carotovora subsp. carotovora, C:
Cymbidiuin).
Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dương các dòng vi khuẩn vừa phân lập được. Kiểm tra nhanh bằng cách sử dụng KOH 3%. Nhỏ một giọt KOH lên phiến kính, sau đó dùng tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc huyền phù trong giọt KOH đó khoảng 2 - 3 phút, nếu nhớt là gram âm ngược lại là gram dương.
3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trường KB và môi trường YDC
Trên môi trường KB: dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy chấm điểm lên môi trường KB. Sau 24 giờ đem chiếu dưới tia UV và quan sát sự phát sáng của vi khuẩn.
Trên môi trường YDC: tương tự như cấy lên môi trường KB. Sau 24 giờ quan sát sự tạo sắc tố và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn.
3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan
Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan với 17 mẫu vi khuẩn phân lập được: EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06- 17, EC06-18, EC06-19. Mỗi mẫu phân lập là một công thức, mỗi công thức tiến hành trên một mẩu củ khoai tây và một lá địa lan, bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại. Các mẩu củ khoai tây và lá địa lan không để vi khuẩn vào dùng làm đối chứng.
Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn trên củ khoai tây Vật liệu
- Vi khuẩn được nuôi trên môi trường YDC. - Củ khoai tây bi không bị sâu bệnh.
- Hộp nhựa có kích thước 20 X 8 cm.
Phương pháp
- Các hộp nhựa được khử trùng bằng cồn 700, dưới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nước cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm.
- Củ khoai tây được rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Để khô tự nhiên sau đó dùng dao đã được khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ và đặt vào hộp. Lấy một miếng thạch có chứa khuẩn lạc vi khuẩn và đặt vào chính giữa mẩu khoai tây. Sau đó, tất cả các hộp được để trong điều kiện nhiệt độ phòng.
Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh vi khuẩn bao nhiêu ngày thì củ khoai tây bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh.
Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên lá địa lan Vật liệu
- Vi khuẩn được nuôi trên môi trường YDC. - Lá địa lan cùng tuổi (tuổi 2) không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thước 20 X 8 cm.
- Giấy thấm đã sấy tiệt trùng, nước cất, cồn 700.
Phương pháp
- Các hộp nhựa được khử trùng bằng cồn 700, dưới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nước cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm.
- Lấy lá địa lan không bị sâu bệnh rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Làm khô tự nhiên sau đó dùng dao lam sạch cắt một đoạn khoảng 20 cm và đặt vào hộp. - Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn chấm lên vết cắt. - Sau khi chủng xong các hộp mẫu được để ở trong phòng lạnh 250C.
Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh bao nhiêu ngày thì lá địa lan bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Sau đó, lấy lá địa lan bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập mẫu: lấy lá địa lan bị bệnh cho vào cốc nước sạch đã hấp tiệt trùng rửa sạch 2 - 3 lần, khử trùng mẫu bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất 2 - 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Đặt mẫu lên môi trường PGA và để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc lên thì quan sát và mô tả.
3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trường LB lỏng
Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trường LB đã hấp tiệt trùng và đậy lại bằng nút bông gòn. Các ống nghiệm này được gói lại thành bó và cho vào máy lắc . Sau 48 giờ tăng sinh dịch vi khuẩn thu được đem ly tâm để thu sinh khối sau đó tiến hành ly trích.
3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
Phương pháp ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của Sambrook và ctv, 2001: Phương pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến. Quy trình thực hiện như sau:
- Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn 10.000 vòng/5 phút/4oC. Rửa sinh khối thu được với 1ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (thường 2- 3 lần).
- Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 ul dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 ul dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ.
- Cho thêm vào 100 ul dung dịch NaCl , hòa tan thật kỹ bằng vortex.
- Thêm vào 80 ul dung dịch CTAB/NaCl ( khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 650C/1O phút.
- Thêm vào 780 ul dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC.
- Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào eppendorf mới. Nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch có thể ly tâm thêm lần nữa ở tốc độ lớn hơn.
- Chiết xuất dung dịch DNA với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14.000 vòng/10 phút/4oC. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào eppendorf mới (khoảng 500 UÌ).
- Kết tủa DNA với dung dịch Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (khoảng 300 ul) và ủ ở tủ - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/10 phút/40C. Thu lấy kết tủa sau khi ly tâm.
- Rửa kết tủa bằng Ethanol 70% (khoảng 500 Lil).Tốt hơn có thể dùng Ethanol 70% được làm lạnh - 200C, nghiêng nhẹ qua lại. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
- Hòa tan kết tủa trong 40 Lil dung dịch TE, đem giữ trong tủ mát 40C trong suốt thời gian thử nghiệm.
3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này được thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTPs 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Xan 1330 100 pmol/pl 10 pmol/pl Xan 322 100 pmol/pl 10 pmol/pl Taq DNA polymerase 5
UI/Lil 1UI
DNA mẫu 10 - 100 ng
H2O cất vừa đủ 25 Lil
Chu kỳ nhiệt
Các bước của phản ứng Nhiệt độ Thời
gian
Giai đoạn khởi động 940C 4 phút
Chạy chu kỳ (30 chu kỳ)
- Biến tính 940C 1 phút
- Bắt cặp 560C 45 giây
Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C
Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Sử dụng cặp primer có các thông số như sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG-<T>- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-<T>- 3'). Hai primer này được thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 434 bp (Darrasse và ctv, 1994).
Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTPs 10 mM 0.2 mM/mỗi loại
Erw1 75 pmol/pl 10 pmol/pl
Erw2 83 pmol/pl 10 pmol/pl
Taq DNA polymerase 5 UI/pl 1UI
H2O cất vừa đủ 25 pl
Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của
phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của
Seo và ctv, 2001.
Các bước của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 950C 5 phút
Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
- Biến tính 940C 30 giây
- Bắt cặp 650C 30 giây
- Kéo dài 720C 45 giây
Giai đoạn kết thúc Giữ ở 40C
720C 10 phút
Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện
trình làm để thu được kết quả tốt
của phản ứng
Điện di và đọc kết quả PCR
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel như sau: cân 0,125g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 6O0C (đến khi nào cầm được mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lược ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 pl sản phẩm PCR và 2 pl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 - 50 phút với cường độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V.
Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 - 20 phút.
Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, được quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt - Lâm Đồng
Hoa lan cũng giống như các loại cây cảnh khác thường xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hương vị, độ tươi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trường trong và ngoài nước, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho người nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật.
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thườngxuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh như sau: xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh như sau:
Trên chồi địa lan
Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan.
a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
(b) (a)
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa.
a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
Trên giả hành
(b)
(c) (d)
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành.
a. Giả hành được cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành được cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành được cắt dọc với triệu chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh.
Trên phát hoa
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vườn điều tra (số liệuđiều tra tháng 10 năm 2005) điều tra tháng 10 năm 2005)
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vườn điều tra.
Vườn điều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do virus Số chậu bệnh do nấm 1 200 60 100 0 2 15.000 3.000 750 3.000 3 1.000 500 100 0 4 7.000 2.800 210 0 5 2.000 1.400 400 800 6 150 0 15 8 7 150 60 15 15 8 20.000 0 0 600 9 300 0 0 0 10 2.500 0 1.750 1.000 11 1.000 800 0 200 12 400 160 80 120 13 400 80 40 100 14 450 45 405 135 15 2.000 0 1.200 200 16 3.500 2.450 350 350 17 500 150 50 50 18 1.000 100 0 100 Tổng cộng 57.550 11.605 5.465 6.678
Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vườn điều tra như sau: bệnh do vi khuẩn: 20,17%, bệnh do virus: 9,5%,bệnh do nấm: 11,6%.
Tác nhân gây bệnh
Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vườn điều tra.
Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hưởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho người trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vườn điều tra (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), có vườn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra. Như thế, không thể kết luận được vườn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh tiềm ẩn, chưa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chưa có quy trình kỹ thuật hợp lý.
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vườn địa lan có bệnh chết cây xuất hiện và vườn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vườn về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vườn đều nhận biết được triệu chứng bệnh và điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhưng đa số các hộ trồng chưa phân biệt được bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra.
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Truớc