Phát hiện vi khuẩn erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan

Phát hiện vi khuẩn erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan bằng phương pháp PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

٭٭٭ 000٭٭٭

PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP PCR

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

KS DƯƠNG THÀNH LAM

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY

Ho Chi Minh City 8/2006

Thầy Lê Đình Đôn đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp

Thầy Dương Thành Lam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

Anh Nguyễn Văn Lẫm, các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị làm việc tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và làm đề tài tốt nghiệp

TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006

Nguyễn Thị Thanh Hà

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng 8 năm 2006

“PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR”

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

1 Điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số vườn trồng địa lan trên địa bàn TP Đà Lạt – Lâm Đồng

2 Phân lập mẫu vi khuẩn và chủng bệnh lên củ khoai tây và lá địa lan 3 Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn phân lập được

4 Khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng 16S/23S rDNA và vùng gen pel mã hóa pectate lyase của vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Kết quả đạt được:

1 Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vườn điều tra: - Bệnh do vi khuẩn: 20,17%

- Bệnh do virus: 9,5% - Bệnh do nấm: 11,6%

2 Phân lập được 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trưng:

- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn 3 Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan:

- Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh sau 48 giờ chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng)

- Trên lá địa lan: hầu như các dòng vi khuẩn đều không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày (ở 250C), duy nhất chỉ có một dòng EC06-8 gây bệnh

4 Khuếch đại được đoạn DNA có kích thước 1,5 kb nằm trong vùng 16S/23S rDNA của các dòng vi khuẩn phân lập được

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Điều kiện tự nhiên của TP Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium 3

2.2 Giới thiệu về lan Cymbidium 3

2.2.1 Phân loại – phân bố 3

2.3.3 Erwinia carotovora subsp carotovora 9

2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra 13

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Vật liệu thí nghiệm 17

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.1.2 Vật liệu 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 18

3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết cây trên địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng 18

3.2.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 18

3.2.3 Quan sát vi khuẩn trên môi trường KB và môi trường YDC 19

3.2.4 Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 19

3.2.5 Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trường LB lỏng 21

3.2.6 Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 21

3.2.7 Thực hiện phản ứng PCR 22

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng 25

4.1.1 Các triệu chứng bệnh trên địa lan 25

4.1.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vườn điều tra 27

4.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 28

4.3 Quan sát vi khuẩn trên môi trường KB và môi trường YDC 29

4.3.1 Trên môi trường KB 29

4.3.2 Trên môi trường YDC 30

4.4 Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan 31

4.4.1 Trên củ khoai tây 31

4.4.2 Trên lá địa lan 32

4.5 Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 32

4.6 Phản ứng PCR 34

4.6.1 Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 34

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Erwina carotovora 8

Hình 4.1 Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan 25

Hình 4.2 Các triệu chứng bệnh trên giả hành 26

Hình 4.3 Các triệu chứng bệnh trên phát hoa 26

Hình 4.4 Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trường PGA 29

Hình 4.5.1 Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường KB chiếu dưới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30

Hình 4.5.2 Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng) 30

Hình 4.6.1 Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng) 31

Hình 4.6.2 Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C) 32

Hình 4.6.3 Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trường PGA 32

Hình 4.7 Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 33

Hình 4.8 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C) 34

Hình 4.9 Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C) 34

Hình 4.10 Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 35

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm

gây ra qua các vườn điều tra 27

Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm

gây ra qua các vườn điều tra 28

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nói đến hoa Đà Lạt, chúng ta không thể nào không nói đến lan Cymbidium Người dân Đà Lạt thường gọi lan Cymbidium là địa lan Địa lan Đà Lạt rất phong phú về chủng

loại, đa dạng về cấu trúc và màu sắc Loài hoa này từng là “sứ giả” của Đà Lạt ở Đông Âu những năm trước 1990 Mặc dù có những biến động bất lợi về thị trường tiêu thụ hoa cắt cành nhưng gần đây, việc nuôi trồng hoa lan với quy mô lớn nhằm mục đích khai thác

kinh doanh đã dần dần được khôi phục Hoa địa lan Cymbidium được nhiều người quan

tâm và đầu tư với quy mô lớn

Tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, người nông dân trồng địa lan tại TP Đà Lạt đang phải đối mặt với bệnh thối làm chết cây Bệnh phát triển nhiều và lây lan nhanh chóng trong mùa mưa Hiện nay, tình trạng bệnh chết cây địa lan vẫn chưa được khống chế do chưa xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh và chưa tìm ra loại thuốc đặc trị hữu hiệu Thiệt hại về kinh tế do căn bệnh này gây ra là rất lớn Đây là nỗi trở ngại, băn khoăn của đa số các hộ trồng địa lan trên địa bàn thành phố Đà Lạt Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây ra bệnh để từ đó xây dựng được quy trình phòng trừ bệnh hữu hiệu giúp giảm thiệt hại do căn bệnh này gây ra cho người trồng địa lan

Với tính cấp thiết của vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phát hiện vi

khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phương

pháp PCR”

1.2 Mục đích – yêu cầu

1.2.1 Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp

carotovora trên cây địa lan (Cymbidium)

1.2.2 Yêu cầu

- Điều tra tình hình bệnh hại tại các vườn trồng địa lan tại TP Đà Lạt – Lâm Đồng - Phân lập mẫu vi khuẩn

- Nhân sinh khối các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora

- Nắm vững quy trình ly trích DNA vi khuẩn

- Khảo sát các yếu tố nhƣ chu kỳ nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp để thiết lập quy trình PCR

1.2.3 Giới hạn

- Đề tài đƣợc thực hiện từ 15/02/2006 đến 30/07/2006 - Chỉ làm đƣợc trên một số mẫu

- Do thời gian và kinh phí có hạn nên không tiến hành giải trình tự sản phẩm PCR

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Điều kiện tự nhiên của TP Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới châu Á với nhiều vùng tiểu khí hậu rất khác nhau, là một trong những nơi tập trung nhiều loài lan của thế giới, đặc biệt là từ các vùng cao nguyên Trung Bộ đến miền Đông Nam Bộ Ở nước ta vương quốc thật sự của các loài lan là những vùng cao nguyên có độ cao từ 800 m đến 1.000 m nhưng đáng kể nhất vẫn là ở Đà Lạt – Lâm Đồng

Thành phố Đà Lạt được đặt trọn trên cao nguyên Lâm Viên với độ cao trên dưới 1.500 m, về phía Đông Bắc tỉnh Lâm Đồng Phía Bắc giáp huyện Lạc Dương, phía Nam giáp huyện Đức Trọng, phía Đông và Đông Nam giáp huyện Đơn Dương, phía Tây và Tây Nam giáp huyện Lâm Hà Nhiệt độ trung bình năm là 18,30C, biên độ nhiệt trong ngày 11 – 120C Khí hậu Đà Lạt chia làm hai mùa rõ rệt, mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm, mùa khô từ tháng 10 năm trước đến tháng 4 năm sau Lượng mưa bình quân hàng năm ở Đà Lạt đạt 1.800 mm.Cường độ mưa tập trung vào các tháng 8, 9 hàng năm Mùa khô kiệt nước là tháng 12, 1 và 2 Nhìn chung, Đà Lạt có khí hậu ôn hòa dịu mát quanh năm, mùa mưa nhiều, mùa khô ngắn, không có bão Đây là những điều kiện hết sức thuận lợi để phát triển nuôi trồng các loại hoa ôn đới trong đó địa lan

Cymbidium là một trong những loại hoa ôn đới đặc thù của Đà Lạt

2.2 Giới thiệu về lan Cymbidium

2.2.1 Phân loại – Phân bố

Phân loại: theo Otto Swartz (1799), chi Cymbidium thuộc:

Giới (Kingdom) : Plantae Lớp (Class) : Liliopsida

Họ phụ (Subfamily) : Epidendroideae

Tông phụ (Subtribe) : Cyrtopodiinae

Giống (Genus) : Cymbidium (http://vi.wikipedia.org/wiki/Hoa_phong_lan)

Phân bố: trên thế giới, các loài Cymbidium phân bố chủ yếu ở châu Á, từ dãy Hy

Mã Lạp Sơn (Hymalaya) đến Nam Trung Quốc (Vân Nam), các nước Đông Dương (Việt Nam, Malaysia, Mianma, Thái Lan) và một vài loài phân bố ở các châu lục khác Phần lớn các loài trong chi này sống ở các vùng rừng núi khá cao, khô và lạnh, một vài loài

khác chịu được điều kiện nóng ẩm của rừng nhiệt đới (Trương Trỗ, 1988) 2.2.2 Đặc điểm thực vật học

Về hình thái bên ngoài, lan Cymbidium là những loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh

hằng năm tạo thành những bụi nhỏ

Rễ: có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn

sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh) Rễ mới thường chỉ mọc ở cây

con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ rễ củ

Thân (căn hành): thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan

với nhau Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể mọc ra căn hành mới, từ đó mọc ra những cây con Do đó mà người ta

xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân

Củ lan (giả hành): thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1 –

15 cm Củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá

Lá: thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính

trên giả hành Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầng phân cách Khi phiến lá rụng vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành Vài loài không có cuống lá Tùy theo

từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trong thịt lá Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng còn lại thường xanh đậm Bản lá và độ dày của lá

thay đổi theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có lá hẹp và dày hơn các loài ưa bóng rợp Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến Đầu lá nhọn hay chia thành hai thùy

Kích thước của bản lá biến động từ 0,5 – 6 cm Chiều dài lá thay đổi từ 10 – 150 cm Chồi hoa: thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già,

đâm ra bên ngoài Thông thường mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Chồi hoa thường xuất

hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn còn chồi thân hơi dẹp

Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Chiều dài của

phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc

Hoa: hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ

nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy), hình bán trụ hơi cong về phía trước Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt Khi chín quả mở theo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia hạt sẽ nảy mầm phát triển thành cây mới (Trương Trỗ, 1988)

2.2.3 Yêu cầu sinh thái đối với Cymbidium

Ánh sáng: nhu cầu ánh sáng từ 50 – 70% ánh sáng trực tiếp với độ chiếu sáng trên

dưới 20.000 lux (khoảng 1/5 độ chiếu sáng của mặt trời vùng Đà Lạt trong khoảng tháng

4 đến tháng 8, từ 11 – 14 giờ) (Trương Trỗ, 1988)

Nhiệt độ: loài lan môi trường lạnh thường đòi hỏi một chế độ nhiệt rất đặc biệt:

khoảng 150C về mùa đông và 200C về mùa hè và chênh lệch ngày đêm khoảng 6 – 70

C Điều này rất cần cho việc ra hoa Khi các giả hành đã phát triển cần có nhiệt độ về đêm từ 6 – 120C liên tục từ 3 – 4 tuần (Trần Văn Bảo, 1999)

Ẩm độ: do là địa lan nên bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký

sinh (epiphyte) Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm (Trần Văn Bảo, 1999) Theo Trương Trỗ (1988), từ 60 – 70% độ ẩm tương đối của không khí và khoảng 70 – 80% độ ẩm của giá

thể là điều kiện tốt cho Cymbidium

2.2.4 Sâu bệnh

Trong nuôi trồng hoa lan thường gặp những dạng dịch hại phổ biến sau:

Bệnh do virus: bệnh do virus gây ra trên hoa lan thường xuất hiện ở hai dạng sau: virus gây khảm lá và virus làm khằn cây

Virus gây khảm lá: gây hiện tượng biến vàng trên lá và hoa Ở lá non có những sọc hay đốm màu xanh nhạt hay màu vàng xen kẽ với những vệt xanh đậm trên phiến lá Trên những cây bị nhiễm nặng, cây không phát triển, bộ rễ còi cọc Bệnh thường xuất hiện trong những vườn lan kém chăm sóc hoặc trên những cây lan bị tách chiết nhiều lần mà

không khử trùng dụng cụ Rầy rệp chích hút cũng là một trong những tác nhân làm lây lan dạng bệnh này

Virus làm khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thường, lá trở nên dày hơn, có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng

Bệnh do virus không có thuốc đặc trị Khi thấy trong vườn có những cây lan có biểu hiện trên, cần phải cách ly để chăm sóc riêng nếu cây bị nhiễm nhẹ Trong trường hợp cây bị nhiễm nặng cần phải đốt bỏ để tránh lây lan sang các cây khỏe mạnh Phải khử trùng dụng cụ sau mỗi lần tách chiết một cây và quan tâm đến công tác phòng trừ rầy rệp, làm vệ sinh mặt chậu và vườn lan thường xuyên

Bệnh do vi khuẩn

Bệnh thối nâu: vết bệnh màu nâu nhạt, hình tròn, mọng nước, về sau chuyển sang

màu nâu đen Bệnh gây hại trên lá, thân, mầm gây nên hiện tượng thối (có mùi khó chịu)

Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra

Bệnh thối mềm: vết bệnh có dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan

rộng theo chiều rộng của phiến lá Trong điều kiện ẩm độ cao sẽ gây hiện tượng thối úng Trong điều kiện khô ráo, mô bệnh khô, teo tóp và có màu trắng xám Nguyên nhân bệnh

do vi khuẩn Pseudomonas Glagioli gây ra

Bệnh do nấm

Bệnh đen thân cây con: vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, có màu nâu, sau

đó lan dần làm khô đoạn thân gần gốc và cổ rễ, vết bệnh chuyển sang màu đen Lá chuyển sang màu vàng, cong dị hình Cây con bị bệnh sau 2- 3 tuần, trong căn hành thường có vệt

màu tím hay hồng nhạt Nguyên nhân bệnh do nấm Fusarium oxysporum gây ra

Bệnh đốm lá: vết bệnh thường có hình thoi hoặc hình tròn nhỏ màu xám nâu, xuất

hiện ở mặt dưới lá Bệnh làm vàng lá, dễ rụng, cây sinh trưởng kém Nguyên nhân bệnh

do nấm Cercospora sp gây ra

Bệnh thán thư: vết bệnh thường có hình tròn nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từ mép

lá, chóp lá hoặc giữa phiến lá, kích thước trung bình 3- 6 mm Giữa vết bệnh hơi lõm có màu trắng xám, xung quanh có gờ nhỏ màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều chấm nhỏ màu

đen Nguyên nhân bệnh do nấm Colletotrichium gloeosrioides gây ra

Ngoài ra, trên cây hoa lan còn có một số dạng bệnh khác như bệnh tàn cánh hoa, bệnh thối trắng rễ, bệnh đốm vàng, bệnh thối đen ngọn, bệnh thối hạch, bệnh đốm vòng trên cánh hoa, bệnh đốm nâu trên cánh hoa…

Côn trùng gây hại: chủ yếu có mấy loại bao gồm bọ trĩ (Thrips palmi và

Dichromothrips Corbetti), nhện đỏ, rệp, sâu hại, ốc sên, nhớt Côn trùng gây hại thường

phát sinh và phát triển trong suốt quá trình nuôi trồng Vì vậy, người trồng lan phải luôn luôn theo dõi, phát hiện kịp thời và có biện pháp phòng trừ thì mới thu được sản lượng và chất lượng tốt (Nguyễn Văn Tới, 2003)

2.2.5 Tình hình sản xuất lan Cymbidium của TP Đà Lạt và trên thế giới

Tại Đà Lạt: Từ năm 1978, Cymbidium Đà Lạt bắt đầu tham gia xuất khẩu sang thị

trường Liên Xô, một ít qua Tiệp Khắc và Singapore, bước đầu 3.000 cành (1978) Có những năm cao điểm lên trên 32.000 cành (1989 – 1990) trên tổng sản lượng 65.000 cành Đến năm 1990, do tình hình biến động ở Đông Âu và Liên Xô, thị trường hoa lan Đà Lạt

bị chững lại, chỉ tiêu thụ nội địa và một ít xuất sang thị trường châu Á Từ năm 1992 –

1998, ngành trồng hoa ở Đà Lạt giảm dần Số lượng hoa lan chỉ còn đủ để tiêu thụ trong

nước Từ năm 1999 đến nay, ngành trồng lan Cymbidium của Đà Lạt mới dần dần hồi

phục nhưng vẫn chưa đủ để đáp ứng nhu cầu xuất khẩu Cuối năm 2004, những bông hoa cắt cành đầu tiên của Việt Nam đã bắt đầu xâm nhập thị trường Mỹ thông qua một tập đoàn nhập khẩu hoa National Wide Wholesale, mỗi tuần từ 1.300 – 1.500 cành chủ yếu đến các siêu thị hoa cao cấp ở bang Massachusetts và Ohio Tuy nhiên bên môi giới vẫn chưa ký hợp đồng chính thức với công ty trên vì chưa đánh giá được nguồn địa lan mà Đà

Lạt có thể cung cấp ổn định so với yêu cầu rất lớn từ phía Mỹ

Trên thế giới: Nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành Hà Lan là

quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu Do trồng trong nhà

kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium Italia là quốc gia

nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu Năm 1993, Italia nhập 75,3 triệu cành chủ yếu là từ

các nước: Thái Lan 64 triệu cành, Hà Lan 10 triệu cành, Singapore 0,75 triệu cành Đức và Pháp là 2 quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và 3 Châu Âu Ở Châu Á, Nhật là quốc

gia nhập khẩu hoa lan đứng đầu Theo thống kê tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành

600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật chủ yếu là Dendrobium, Cymbidium Thái

Lan là nước xuất khẩu hoa lan đứng đầu thế giới, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá từ 3 – 5 USD/cành, có khi tới 80 – 100 USD/ cành, những giống quý có thể lên tới

hàng ngàn USD (Trích Lê Hữu Quang, 2005)

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora và tác hại của nó 2.3.1 Phân loại: Theo Winslow và ctv (1920), loài Erwinia thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Phylum) : Proteobacteria Lớp (Class) : - Proteobacteria Bộ (Order) : Enterobacteriales Họ (Family) : Enterobacteriaceae

Giống (Genus) : Erwinia (Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Erwinia )

(Nguồn: http://www.soc.nii.ac.jp/jssm/Erwinia%20carotovora.jpg )

Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, được chia thành 2

nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora”

2.3.2 Erwinia carotovora

Erwinia carotovora là tác nhân gây ra bệnh thối mềm (soft rot), một bệnh rất nguy

hiểm và tàn phá cây trồng Nhiều loại thực phẩm có giá trị kinh tế như khoai tây, cà chua,

cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hưởng bởi bệnh này Loài Erwinia carotovora là

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Erwinia carotovora

a Vi khuẩn có dạng hình gậy b Lông roi bao quanh thân

a

b

một đơn vị phân loại phức tạp mà những dòng này thì đa dạng ở những mức độ khác nhau

(sinh lý, huyết thanh học, đặc tính di truyền và dãy kí chủ) Erwinia carotovora được chia thành 5 nhóm phụ (subspecies) gồm: E c atroseptica (Eca), E c carotovora (Ecc), E c betavasculorum (Ecb), E c wasabiae (Ecw), E c odorifera (Eco) (Seo và ctv, 2001)

2.3.3 Erwinia carotovora subsp carotovora

Phân bố địa lý: Erwinia carotovora subsp carotovora là một loại vi khuẩn phân

bố rộng khắp mà nó là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên các loại cây cảnh

(ornamental) và cây nông nghiệp (horticultural) khác nhau Erwinia carotovora subsp carotovora phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới và ôn đới, có phổ kí chủ rộng hơn

những nhóm phụ khác (Fiori và Schiaffino, 2003)

Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử: vi khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng di động do có lông roi bao quanh và có kích thước trung bình từ 0,6 – 0,7 2 – 2,5 μm Bằng phương pháp thử

các phản ứng sinh hóa đã xác định được Erwinia carotovora subsp carotovora: vi khuẩn

Gram âm, kị khí tùy nghi (facultative anaerobe), catalase (+), oxidase (-), Indole (-), hóa lỏng pectate (liquefied pectate) trên môi trường CVP, khử nitrate thành nitrite, không phát sáng trên môi trường KB, phân giải esculine và gelatine nhưng không phân giải tinh bột,

tạo acetoin và H2S nhưng không tạo urease, tạo phản ứng quỳ sữa (acidized litmus milk), không có khả năng thủy giải arginine hoặc khử sucrose, kháng erythromycin, lên men

glucose, chịu đựng được 5% NaCl và có thể phát triển được ở 370C, tạo acid từ arabinose,

cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose, inositol, manitol và sorbitol Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn

không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và

malate Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate, nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không

(Fiori và Schiaffino, 2003)

Đường lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đường tự nhiên như

khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thương gây ra bởi

côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002)

Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp carotovora là tác nhân gây bệnh

cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tương tác giữa nó với ký chủ và môi trường Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc như các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes) Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế

bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự

phát triển của bệnh Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl), polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây hư hại tế bào và làm mô suy yếu Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa pectate lyase đã biết trình tự Có 3 họ đã được xác định và giữa chúng có tính tương đồng

cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia chrysanthemi, nhóm thứ ba tương ứng với gen được tìm thấy trên một vài dòng Erwinia

carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family) Cellulases hoạt động

trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc pH tối ưu gần bằng 7, cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ

1,4-β-D-cấp của cây trồng Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác

cũng ảnh hưởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ chế kháng của ký chủ Các nhân tố này bao gồm tính di động (motility), LPS

(lipopolysaccharides), kị sắt (siderophores), gen hrp (hypersensitive reaction and

pathogenicity), NLPs (Nep-1 like protein) (Nep: necrosis and ethylene inducing peptide) và những nhân tố chống lại sự phá hủy của oxy (oxygen damage) hoặc những peptide

kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005)

Triệu chứng: triệu chứng phổ biến rất đặc trưng cho các loài vi khuẩn Erwinia

carotovora là hiện tượng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải, hành tây,…Hiện tượng

thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối

nhão, có mùi (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Mức độ gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora: bệnh thối

mềm là một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng kí sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau Hiện nay chưa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn

Năm 1995, tại Argentina, trái và cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill

hybrid Tommy) từ các nhà kính thương mại (commercial greenhouses) gần La Plata và

gần Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp carotovora Tỉ lệ bệnh 2% là phổ biến và gần 10% cây ở vùng ẩm ướt trong nhà kính thì

Vụ đông và đông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thương mại (several commercial plastic- covered greenhouses) ở Mersin và Antakya, vùng phía đông Địa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ Phạm vi tác động của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80 – 90% nhà kính ở Mersin và Antakya Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty acid methyl ester) người ta đã xác định được nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn

Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp carotovora và Erwinia chrysanthemi

Ở New Zealand, một loại vi khuẩn được phân lập từ những củ cala (Zantedeschia spp ) bị nhiễm bệnh được xác định là Erwinia carotovora subsp carotovora Báo cáo này cho thấy Erwinia carotovora subsp carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối

mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998)

Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora

Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia

carotovora subsp carotovora bằng nhiều phương pháp khác nhau.Với sự phát triển vượt

bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời như PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã

tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật

Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phương pháp PCR để phát hiện

và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan Bằng cách sử

dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading

frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để khuếch đại đoạn 420 bp trong khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia chrysanthemi Kết quả chỉ có cặp primer Y1 và Y2 khuếch đại được đoạn gen mong

muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được (Phokum và ctv)

Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phương pháp PCR – RFLP trên gen pel (mã hóa

pectate lyases) để xác định mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai

tây Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một đoạn 434 bp của

những dòng Erwinia carotovora Trong 89 dòng Erwinia carotovora được kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora subsp betavasculorum là không phát hiện thấy RFLP được thực hiện trên đoạn được khuếch đại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI, HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự đa hình giữa các dòng

Seo và ctv, (2001) đã sử dụng phương pháp PCR – RFLP nghiên cứu về kiểu hình

và đa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp carotovora (Ecc)

phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan Thí nghiệm tiến

hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R,

gen pel mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2 Bằng phân tích RFLP trên sản phẩm khuếch đại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự

đa hình giữa các dòng nghiên cứu Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng đã sử dụng phương pháp PCR – RFLP và RAPD để nghiên cứu về mặt kiểu hình và đặc tính di

truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.) Thí

nghiệm được tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn được phân lập từ cây dâu tằm Bằng phương pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này được chia thành 2 loại: type 1 và type 2 Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc Bằng nghiên cứu qua nhiều giai đoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học

(serological assay), PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp atroseptica (Eca),

PCR – RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi khuẩn

thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn là Ecc và Eca

Fiori và Schiaffino, (2003) cũng sử dụng phương pháp PCR – RFLP để nghiên cứu

vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2

cho phép khuếch đại một trình tự có kích thước 434bp Phân tích RFLP trên sản phẩm

PCR được tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì

thấy có sự đa hình giữa các dòng

Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa thấy có tài liệu nào nói về

việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn

Erwinia carotovora subsp carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium)

2.3.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra

Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại được sử dụng để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dư cây trồng, trong đất, nước và các vector truyền khác Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng được truyền thông qua hạt giống hoặc các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây

trồng có tầm quan trọng sống còn để đảm bảo một nền nông nghiệp an toàn và bền vững (Yeshitila và ctv, 2006)

Chẩn đoán theo triệu chứng: một loài vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn hại cây

có thể gây ra những loại triệu chứng bệnh đặc trưng Tuy nhiên, dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể xác định chẩn đoán đúng trong rất ít trường hợp.Trên một loài cây, nhiều loài vi khuẩn khác nhau và nhiều loại vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra các triệu chứng bệnh tương tự giống nhau rất khó phân biệt như các loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng…(Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Chẩn đoán bằng phương pháp vi sinh: để xác định bệnh do vi khuẩn gây ra, cần

thiết phải khẳng định sự có mặt của vi khuẩn trong mô bệnh, phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đó lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh của chúng trên cây kí chủ theo quy tắc Koch Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trưởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hóa để có cơ sở phân loại, giám định loại (giống) và loài vi khuẩn cần chẩn đoán (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Chẩn đoán bằng phương pháp sinh hóa: một số chỉ tiêu cần thiết để giám định

loài vi khuẩn cần chẩn đoán phải được khảo sát nghiên cứu bằng phương pháp thử các phản ứng sinh hóa riêng biệt Các loại (giống) vi khuẩn khác nhau phân biệt về nhu cầu, khả năng sử dụng các chất dinh dưỡng và về kiểu trao đổi chất (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh: là một phương pháp chẩn đoán

nhanh bệnh vi khuẩn được ứng dụng trong bệnh cây nhất là trong việc kiểm tra, chọn lọc

giống, vật liệu làm giống sạch bệnh và trong kiểm dịch thực vật Phương pháp huyết

thanh chẩn đoán vi khuẩn dựa trên cơ sở phản ứng có tính đặc hiệu cao giữa kháng nguyên và kháng thể tương ứng Tế bào vi khuẩn là những kháng nguyên, là một khảm kháng nguyên trong đó kháng nguyên O (ở tế bào) và kháng nguyên H (lông roi) có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng phương pháp huyết thanh để chẩn đoán, xác định loài vi khuẩn gây bệnh một cách nhanh chóng và khá chính xác Người ta đưa kháng nguyên vi

khuẩn vào trong cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh để thực hiện việc chẩn đoán