4.3.1. Trên môi trƣờng KB
Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia UV. Theo Fiori và Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora
không phát sáng trên môi trƣờng KB. Do đó, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc những dòng không phát sáng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.5.1).
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA.
a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
4.3.2. Trên môi trƣờng YDC
Theo Seo và ctv (2001), khi thử nghiệm sinh lý, sinh hóa trên 87 dòng vi khuẩn
Erwinia carotovora subsp. carotovora thì thấy trong 22 dòng Thái Lan có 5 dòng sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC, 23 dòng Hàn Quốc và 24 dòng Nhật Bản đều không sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC. Nhƣ vậy, giữa các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora có sự đa dạng về đặc tính kiểu hình phenotyp, do chúng có phổ ký chủ và sự phân bố địa lý rộng.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trƣờng YDC để xem sự sản sinh sắc tố vàng và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. Sau 24 giờ quan sát thấy trên môi trƣờng YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu rất đặc trƣng (Hình 4.5.2).
- Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
a
Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
b
a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. a a b a a
Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng).
a. Khuẩn lạc vi khuẩn phát sáng khi chiếu dƣới tia UV, tạo thành quầng sáng xung quanh.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn không phát sáng khi chiếu dƣới tia UV.
b a
4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, lá địa lan
Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trƣờng YDC, chúng tôi tiến hành chủng lên củ khoai tây và lá địa lan.
4.4.1. Trên củ khoai tây: sau 48 giờ chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu
hiện nhƣ sau:
Sau 48 giờ chủng vi khuẩn, quan sát thấy 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây hại mạnh: EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 và EC06-19 với các triệu chứng nhƣ hình 4.6.1. Ngoài ra, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của vi khuẩn bị giảm.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng).
a. Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày. b. Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày. c. Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng. d. Vết bệnh hơi lõm xuống, nhày, xung quanh vết bệnh có đƣờng viền màu nâu nhạt.
4.4.2. Trên lá địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhƣ các dòng vi khuẩn
không gây bệnh trên lá địa lan. Chỉ duy nhất có dòng EC06-8 gây bệnh. Vết bệnh có màu vàng xanh, lan theo chiều rộng của phiến lá. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có viền màu nâu đen (Hình 4.6.2).
Sau đó, chúng tôi đã tiến hành phân lập lại từ lá địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu hiện bệnh. Kết quả thu nhận đƣợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (Hình 4.6.3).
4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó, chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,…Có nhiều phƣơng
Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA.
Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250 C).
a. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có màu nâu đen.
b. Vùng bị bệnh có màu vàng xanh.
a b
pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Tuy giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng.
Chúng tôi đã tiến hành ly trích một số dòng vi khuẩn. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra DNA. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở hình 4.6.
Qua hình trên cho thấy các mẫu ly trích có độ tinh sạch chƣa cao. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (RNA và protein) ở phía dƣới. Có thể loại bỏ đƣợc phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNAse. Có một số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài. Tuy nhiên, DNA thu đƣợc tƣơng đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Trƣớc khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong nƣớc cất vô trùng hoặc TE 1X. Do lƣợng DNA mẫu dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lƣợng DNA mẫu quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose để kiểm tra.
Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn.
1. EC06-1, 2. EC06-3, 3. EC06-5, 4. EC06-6, 5. EC06-7, 6. EC06-8, 7. EC06-9, 8. EC06-10. Điện di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 3 μl mẫu/giếng.
DNA tổng số
Phần tạp nhiễm
4.6. Phản ứng PCR
4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Chúng tôi đã tiến hành chạy PCR trên các dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC06- 6, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer Xan 1330 và Xan 322.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. Tuy nhiên thấy xuất hiện 2 band điều đó chứng tỏ có sự tạp nhiễm. Lý do của sự tạp nhiễm này có thể đƣợc giải thích có thể tạp nhiễm trong khi ly trích hoặc tạp nhiễm khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Để khắc phục hiện tƣợng này, chúng tôi đã nâng nhiệt độ bắt cặp từ 560
C lên 580C. Kết quả là thu đƣợc một band.
1 2 3 4
Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560 C).
1. EC06-1, 2. EC06-8, 3. EC06-9, 4. EC06-19. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.
Sản phẩm PCR
1 2 3 4
Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580
C).
1. EC06-8. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng.
Sản phẩm PCR
Trình tự 16S rDNA là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa , phân loại vi khuẩn và đã đƣợc xác định cho nhiều loài vi khuẩn. Trình tự 16S rDNA và vùng hoạt động giữa 16S – 23S rDNA chỉ ra sự biến đổi giữa các dòng trong cùng một loài. Dựa vào vùng này để phát hiện ra sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn.Cặp primer chúng tôi sử dụng đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA, cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb. Khi kiểm tra trên Genbank chúng tôi thấy cặp primer này có thể khuếch đại trên một số loài khác. Nhƣ thế, chúng tôi chƣa thể khẳng định đƣợc vi khuẩn chúng tôi đang nghiên cứu chính xác là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2.
4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Primer Y1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3'), Y2 (5'-
CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3') đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA có
kích thƣớc 434bp. Trình tự của mỗi mồi đã đƣợc kiểm tra trên Genbank và EBML (Darrasse và ctv, 1994).
Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng sử dụng cặp primer có trình tự giống nhƣ mô tả của Darrasse và ctv (1994) nhƣng có tên khác là Erw1 và Erw2. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 với chu kỳ nhiệt nhƣ đã nêu ở mục 3.2.7. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra. Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR không xảy ra (Hình 4.10).
Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2.
Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 μl/giếng.
Theo chúng tôi có nhiều nguyên nhân khiến cho phản ứng PCR không xảy ra: - Nhiệt độ nóng chảy (melting) của hai primer tƣơng đối cao (84,90C và 73,70C) do trong thành phần có nhiều GC (66% và 50%). Quy trình ban đầu chúng tôi thực hiện nhiệt độ giai đoạn bắt cặp là 650C nhƣ thế là tƣơng đối cao. Nhƣng kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại. Do đó, chúng tôi tiến hành giảm xuống 620C, 600C, 580C nhƣng vẫn không có kết quả.
- Nguyên nhân thứ hai có thể do nồng độ các chất tham gia phản ứng quá thấp nên không đủ cho phản ứng PCR xảy ra. Lƣợng Taq ban đầu chúng tôi sử dụng là 0,1μl/UI, có thể là thấp không đủ để xúc tác cho phản ứng xảy ra. Chúng tôi tiến hành tăng lƣợng Taq từ 0,1μl/UI lên 0,2μl/UI đồng thời tăng nồng độ primer từ 10 pmol lên 20 pmol. Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến quá trình PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại, nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Khoảng nồng độ cho phép của Mg2+
từ 1 – 5 mM (McPherson, M. J. và Møller, S. G. 2000). Từ đó, chúng tôi tiến hành tăng nồng Mg2+ từ 1,5 mM lên 2 mM, 2,5 mM, 3 mM nhƣng vẫn không cho bất kỳ kết quả nào. Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ các hóa chất là không hiệu quả.
- Nguyên nhân thứ ba có thể do số chu kỳ khuếch đại chúng tôi sử dụng ban đầu (35 chu kỳ) là tƣơng đối dài. Vì vậy, chúng tôi đã giảm từ 35 xuống 30 chu kỳ, 25 chu kỳ nhƣng vẫn không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra cả.
Qua các thí nghiệm thay đổi các điều kiện của phản ứng PCR, kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại tạo ra.. Có nhiều lý do để giải thích cho vấn đề này. Thứ nhất, các mẫu địa lan khi bị thối có thể có nhiều loại vi sinh vật khác tấn công do đó có thể trong các mẫu vi khuẩn chúng tôi phân lập không có sự hiện diện của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora. Thứ hai là có thể có sự tạp nhiễm khi phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Thứ ba là có thể các điều kiện của phản ứng chúng tôi thay đổi chƣa phù hợp. Do hạn chế về mặt thời gian nên chúng tôi vẫn chƣa tìm ra đƣợc một quy trình PCR thích hợp cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
1. Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các vƣờn lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Qua kết quả điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn (20,17%) so với tỉ lệ nhiễm bệnh do virus (9,5%) và nấm (11,6%).
2. Kết quả phân lập vi khuẩn thu đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Kết quả chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan:
- Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh.
- Trên lá địa lan : hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày, duy nhất chỉ có dòng EC06-8 gây bệnh.
4. Quy trình tách chiết DNA khá đơn giản, đảm bảo lƣợng DNA thu đƣợc có độ tinh sạch cao phục vụ tốt cho việc chạy PCR. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 3.2.6.
5. Kết quả phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 đã khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1,5 kb.
5.2. Đề nghị
Từ những khó khăn, trở ngại gặp phải trong quá trình nghiên cứu nên chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau:
1. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Bởi vì, nguồn mẫu ban đầu là rất quan trọng, phải khẳng định chắc chắn trƣớc khi tiến hành các thử nghiệm tiếp theo ở mức độ phân tử.
2. Cần có một mẫu đối chứng dƣơng là điều rất quan trọng và cần thiết.
3. Thiết lập lại quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Trần Văn Bảo, 1999. Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản trẻ. 175 trang.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp - Ứng dụng). Nhà xuất bản Giáo dục.
3. Nguyễn Văn Minh, 2005. Điều tra bệnh chết cây và kỹ thuật trồng địa lan (Cymbidium) tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp Ngành Nông Học 2005. 4. Lê Hữu Quang, 2005. Nghiên cứu một số loại giá thể cho cây hoa địa lan (Cymbidium) trồng tại TP. Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học 2005.
5. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Trang 7 – 118.
6. Nguyễn Văn Tới, 2003. Một số vấn đề bảo vệ thực vật trong nuôi trồng hoa địa lan Cymbidium. http://www.lamdong.gov.vn/rauhoadl/DesktopDefault.aspx?tabid=64.
7. Trƣơng Trỗ, 1988. Đà Lạt Cymbidium. Sở khoa học, công nghệ và môi trƣờng Lâm Đồng.http://www.lamdong.gov.vn/cdrom/Dulich/Dacsan/Cymbidium/Images/cymbidium. jpg&imgrefurl=...
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
8. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Mirik M. New symptoms of tomato soft rot diseases in Turkey.http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695_32.htm.
9. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Cetinkaya-Yildiz R. Present status of bacterial stem rot on tomato in Turkey. http://www.pubhort.org/actahort/books/695/695_10.htm.
10. Cerkaukas R. F. and Brown J. 2001. Bacterial stem and peduncle canker of greenhouse pepper.
http://ginkgo.cisti.nrc.ca/ppv/RPViewDoc?_handler_=HandleInitialGet&journal=tcjpp&v olume=23&articleFile=k01-019.pdf
11. Christopher P. K. and David H. P. 1999. Ribosomal DNA Sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology, 2: 299 – 305.
12. Darrasse A., Priou S., Kotojansky A. and Bertheau Y. 1994. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gen as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases. Applied and Environmental. Microbiology, May, p.1437 – 1443.
13. Fiori M. and Schiaffino A., 2003. Bacterial Stem Rot in Greenhouse Pepper (Capsicum annuum L. ): Occurrence of Erwinia carotovora sbsp. carotovora. J.Phytopathology. 152, 28 – 33.
14. Heidi Hyytiainen, 2005. Regulatory networks controlling virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora ssp. carotovora. Department of Biological and Environmental Sciences. Faculty of Biosciences. University of Helsinki.57 pages.
http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/bio/bioja/vk/hyytiainen/regulato.pdf.
15. Kang H. W., Kwon S. W. and Go S. J. 2003. PCR – based specific and sensitive detection of Pectobacterium ssp. carotovorum by primers generated from a URP – PCR fingerprinting – derived polymorphic band. Plant pathology. 52, 127 – 133.
16. Khoodoo M. H. R., Sahin F., Donmez M. F. and Jaufeerally Fakim Y. 2004.