Ảnh hưởng của PRP-HGF trong nuôi cấy lên hiệu quả điều trị bệnh xơ gan của việc cấy ghép tế bào gốc

Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (ADSC) có nhiều tiềm năng trong điều trị bệnh lý xơ gan. Yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF) và huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) có vai trò quan trọng trong phục hồi tổn thương, đặc biệt ở gan. Trong nghiên cứu này, hADSC được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung HGF và PRP trong 7 ngày, sau đó ghép lên mô hình chuột xơ gan và đánh giá hiệu quả tại thời điểm 7 ngày sau cấy ghép.

Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học ẢNH HƯỞNG CỦA PRP-HGF TRONG NUÔI CẤY LÊN HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH XƠ GAN CỦA VIỆC CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC Đặng Minh Thành (1,3), Nguyễn Thị Kim Yến(1,3), Võ Hồng Ngọc(2,3), Nguyễn Hải Nam(1,3), Lê Văn Trình(1,3), Trương Hải Nhung(1,3)* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trường Đại học Quốc tế – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Viện Tế bào gốc – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: thnhung@hcmus.edu.vn TĨM TẮT Tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ (ADSC) có nhiều tiềm điều trị bệnh lý xơ gan Yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF) huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) có vai trò quan trọng phục hồi tổn thương, đặc biệt gan Trong nghiên cứu này, hADSC nuôi cấy mơi trường có bổ sung HGF PRP ngày, sau ghép lên mơ hình chuột xơ gan đánh giá hiệu thời điểm ngày sau cấy ghép Các kết thu cho thấy liệu pháp ghép ADSC nuôi môi trường có bổ sung HGF kết hợp PRP giúp cải thiện số cân nặng, giảm hoạt độ men ALT, giảm viêm thông qua giảm số lượng bạch cầu tổng, giảm biểu gen liên quan đến xơ hóa Pro-collagen α-SMA, so với nhóm chuột ghép ADSC ni mơi trường ni cấy thơng thường Ngồi ra, liệu pháp cịn giúp hồi phục cấu trúc mơ gan Từ khóa: Tế bào gốc trung mơ từ mơ mỡ, yếu tố tăng trưởng tế bào gan, huyết tương giàu tiểu cầu, liệu pháp ADSC/HGF+PRP, xơ gan THE EFFECT OF HGF-PRP SUPPLEMENT IN CELL CULTURE MEDIUM ON CIRRHOSIS TREATMENT EFFICIENCY USING STEMCELL Dang Minh Thanh (1,3), Nguyen Thi Kim Yen(1,3), Vo Hong Ngoc(2,3), Nguyen Hai Nam(1,3), Le Van Trinh(1,3), Truong Hai Nhung(1,3)* University of Science – VNU Ho Chi Minh City International University – VNU Ho Chi Minh City Stem cell institute – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: thnhung@hcmus.edu.vn ABSTRACT Adipose-derived stem cells (ADSCs) have the potential therapeutic impact on the liver fibrosis Hepatocyte growth factor (HGF) and Platelet rich plasma (PRP) are pivotal for damage repair, especially liver damage In this study, ADSC/ HGF+PRP were prepared by culturing hADSCs for seven days in the medium supplemented HGF and PRP, then injected in liver fibrosis models, and was evaluated after seven days and fourteen days of cell transplantation The results showed that the therapy using ADSC pretreated with HGF and PRP ameliorated the liver fibrosis via the improvement of the body-weight, the attenuation of ALT level and the total number of leukocyte, the down-regulation of Pro-collagen and smooth muscle actin (-SMA) expression and the histological change, in the comparison to the ADSC group Keywords: Adipose-derived stem cells, Hepatocyte growth factor, Platelet rich plasma, ADSC/HGF+PRP therapy, liver fibrosis glycogen Xơ gan giai đoạn muộn bệnh mạn tính gan dẫn đến thay đổi cấu trúc chất ngoại bào gan Bản chất q trình xơ hóa chữa lành tổn thương q mức, từ mơ liên kết tạo nhiều chất TỔNG QUAN Gan quan lớn bên thể, đảm nhận nhiều chức quan trọng như: sản xuất dich mật hỗ trợ cho q trình tiêu hóa, tham gia tổng hợp đại phân tử (protein, carbohydrate, lipid) dự trữ 59 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 ngoại bào ECM (extracellular matrix) sản xuất với số lượng lớn với cấu trúc, thành phần bất thường Có nhiều nguyên nhân dẫn đến xơ gan: nhiễm hóa chất công nghiệp, uống rượu nhiễm virus HBV, HCV thời gian dài Những thống kê gần cho thấy, Việt Nam có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B cao, chiếm tỷ lệ khoảng 10 – 20% dân số, khoảng 20% trường hợp viêm gan B chuyển thành xơ gan Trong năm gần đây, năm, Việt Nam có 8.000 đến 10.000 ca mắc bệnh gan Ở giai đoạn xơ gan tiến triển, liệu pháp cuối cấy ghép gan Tuy nhiên, nhược điểm liệu pháp khan nguồn gan hiến tặng, bệnh nhân phải dùng thuốc ức chế miễn dịch để tránh thải loại mơ ghép Vì vậy, việc tìm liệu pháp thay cần thiết Rất nhiều nghiên cứu thực nghiệm liệu pháp cấy ghép tế bào cho nhiều kết khả quan Các liệu pháp cấy ghép tế bào bao gồm cấy ghép tế bào gan, tế bào gốc từ gan tế bào gốc không thuộc gan Ngày nay, có nhiều nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị xơ gan tiến hành cách ứng dụng loại tế bào gốc khác nhau: tế bào gốc phôi, tế bào gốc vạn cảm ứng, tế bào gốc trưởng thành Trong đó, tế bào gốc trung mơ (MSC) - loại tế bào gốc trưởng thành, ứng dụng nhiều MSC thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, đó, tế bào gốc trung mơ thu từ mơ mỡ (ADSC) có nhiều ưu điểm: số lượng dồi dào, dễ dàng thu nhận phương pháp xâm lấn, tỷ lệ phân lập cao, khả tăng sinh in vitro mạnh Để ứng dụng ADSC điều trị xơ gan, có hai hướng chính: - Ghép trực tiếp tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ không qua nuôi cấy tăng sinh in vitro - Tiến hành nuôi cấy tăng sinh in vitro tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ trước cấy ghép Đối với hướng đầu tiên, ghép trực tiếp ADSC không qua nuôi cấy in vitro gặp phải trở ngại số lượng tế bào ghép không đủ Ở hướng thứ hai, tiến hành nuôi cấy tăng sinh ADSC trước ghép khắc phục nhược điểm số lượng tế bào ghép, lại gặp trở ngại protein dị loài phần lớn môi trường nuôi tế bào Kỷ yếu khoa học bổ sung thêm FBS (Fetal Bovine Serum) FCS (Fetal Calf Serum) Để khắc phục khiếm khuyết này, nhà khoa học chuyển sang sử dụng PRP để thay cho FBS/FCS PRP huyết tương có nồng độ tiểu cầu cao mức bình thường Thực tế PRP có nồng độ cao lần so với nồng độ tiểu cầu bình thường (1 triệu tế bào/ml) Nhiều nghiên cứu việc kết hợp ADSC với PRP kích thích tăng sinh tế bào mức in vitro, đồng thời làm tăng khả trì tính gốc ADSC Ngoài ra, số nghiên cứu khác chứng minh bổ sung HGF vào môi trường nuôi cấy ADSC giúp kích thích tế bào di cư vị trí tổn thương Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tiến hành nuôi cấy hADSC mơi trường có bổ sung HGF kết hợp PRP đánh giá hiệu ghép tế bào lên mô hình chuột xơ gan VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo mơ hình chuột xơ gan CCl4 Chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) giới tính đực, tuần tuổi, cân nặng 30 - 35g nhập từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Chuột gây xơ gan theo quy trình tác giả Trương Hải Nhung cộng Chuột cho uống CCl4 với liều 1ml/kg pha dầu olive, lần/tuần 11 tuần Mơ hình chuột đánh giá thơng qua tiêu khối lượng, số ALT, số lượng bạch cầu tổng, biểu gen (Procollagen – α1, α – SMA), cấu trúc mô học thông qua nhuộm H&E Giải đơng ni cấy hADSC Dịng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người (hADSC) giải đông từ ngân hàng tế bào Viện Tế bào gốc (Tp Hồ Chí Minh) hADSC ni mơi trường DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) có bổ sung 10% FBS Khi mật độ tế bào đạt 70 – 80% bề mặt bình ni, tiến hành cấy chuyền Khi tế bào đạt đủ lượng, tiến hành nuôi hADSC mơi trường có bổ sung HGF (20ng/ml) HGF (20ng/ml) kết hợp với PRP (10%) vòng ngày Thu nhận hoạt hóa huyết tương giàu tiểu cầu từ máu cuống rốn Máu cuống rốn thu nhận khoa sản 60 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học bệnh viện quận 2, TP Hồ Chí Minh bước sóng 340 nm (bộ kit GPT (ALAT) Huyết tương giàu tiểu cầu thu nhận từ IFCC Mod.liquiUV test – HUMAN - Đức) máu cuống rốn phương pháp ly tâm hoạt hóa CaCl2 1M XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẠCH CẦU Cấy ghép tế bào hADSC TỔNG Thu nhận tế bào từ bình ni, lọc màng Máu từ tĩnh mạch đuôi chuột trộn với lọc 70 µl để tách tế bào đơn Mật độ tế bào dung dịch ly giải hồng cầu buồng trộn sau xác định cách nhuộm với Số lượng bạch cầu tổng (tế bào/ml) Trypan Blue đếm buồng đếm hồng tính theo cơng thức: cầu (N1 + N2 + N3)/3 x 20 x 104 Chuột mơ hình chia thành nhóm thí (N1, N2, N3: Tổng số bạch cầu tổng lần nghiệm Nhóm đối chứng: tiêm 0.2 ml PBS; đếm) nhóm ADSC: tiêm hADSC; nhóm Đánh giá biểu gen qRT ADSC/HGF: tiêm hADSC nuôi cấy PCR mơi trường có bổ sung HGF; nhóm RNA tổng số tách từ mô gan ADSC/HGF+PRP: tiêm hADSC nuôi Kit Easy – BLUETM (iNtrON Biotechnology cấy môi trường bổ sung HGF PRP – Hàn Quốc) Các gen liên quan đến xơ hóa Tế bào ghép lên chuột mơ hình với liều khuếch đại phản ứng Realtimelượng 5x105 tế bào pha loãng PBS PCR (bộ kit qPCRBIO SyGreen 1-Step theo đường tĩnh mạch đuôi Detect Lo-ROX, PCR Biosystems - Anh), sử dụng cặp mồi có trình tự Bảng Mức Đánh giá tiêu sinh hóa Máu thu từ tĩnh mạch cảnh chuột Máu độ biểu gen mục tiêu đo gồm huyết tương tế bào máu Do đó, lường thơng qua so sánh chu kỳ ngưỡng (Ct để thu nhận huyết tương, tiến hành loại bỏ – Cycle threshold) với gen GADPH tế bào máu khỏi hỗn hợp phương tính cơng thức 2- Ct pháp ly tâm Hoạt độ men ALT đo Bảng Trình tự cặp mồi gen liên quan đến xơ hóa STT Tên gen Trình tự mGapDH Mồi xi: AAGTTGTCATGGATGACC Mồi ngược: TCACCATCTTCCAGGAGC Pro-collagen Mồi xuôi: CCTGGACGCCATCAAGGTCTAC Mồi ngược: CCAAGTTCCGGTGTGACTCG α-SMA Mồi xuôi: GCATCCACGAAACCACCTA Mồi ngược: CACGAGTAACAAATCAAAGC Đánh giá mô học nhuộm Giảm hoại tử tế bào gan thông qua giảm hoạt độ men ALT Cụ thể, hoạt độ ALT Haematoxylin Eosin (H&E) Mẫu gan cố định dung dịch giảm nhóm hADSC (2 lần), Paraformaldehyde 4% (Merk Milipore, Đức) ADSC/HGF (2 lần) nhóm Mơ cắt lát nhuộm H&E theo quy hADSC/HGF+PRP (2.9 lần) so với nhóm trình Bệnh viện Chợ Rẫy (TP Hồ Chí tiêm PBS, khác biệt có ý nghĩa thống Minh) kê (Hình 1A) Điều giải thích hADSC có khả làm giảm gốc oxy Phương pháp xử lý thống kê Kết trình bày theo dạng: giá trị hóa tự ROS thơng qua tăng biểu trung bình  SEM Số liệu xử lý superoxide dismutase (SOD) phần mềm Prism 6.50, mức độ khác biệt malondialdehyde (MDA) so sánh sử dụng Student’s t-test, với độ Chỉ tiêu số lượng bạch cầu tổng Giảm viêm thông qua giảm số lượng bạch tin cậy p < 0.05 cầu tổng ba nhóm ghép tế bào (nhóm hADSC giảm 1,20 lần; nhóm ADSC/HGF KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Sau ngày ghép x 105 tế bào ADSC, liệu 1,25 lần nhóm hADSC/HGF+PRP 1,64 lần) so với nhóm tiêm PBS (Hình 1B) Điều pháp giúp cải thiện xơ hóa thơng qua: giải thích hADSC có Chỉ tiêu sinh hóa 61 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 khả ức chế phản ứng viêm mô gan thông qua ức chế tế bào TCD4, đại thực bào, theo công bố tác giả Higashimoto cộng vào năm 2013 Ngoài ra, theo tác giả Mahammadzadech, hADSC kích thích tế bào Treg, đồng thời ức chế Th1, Th2, Th17 thơng qua điều hịa biểu Giảm biểu gen α-SMA Procollagen (hình 1C, 1D) Cụ thể, chúng tơi ghi nhận giảm biểu α-SMA (nhóm ADSC giảm 2,82 lần; nhóm ADSC/HGF giảm 9,94 lần; nhóm ADSC/HGF+PRP giảm 14,41 lần) so với nhóm chuột tiêm PBS (Hình 1D) Gen αSMA đặc trưng cho hoạt hóa tế bào hình tế bào trực tiếp tiết ECM, gây xơ gan Do đó, giảm mức độ biểu Kỷ yếu khoa học cytokine liên quan đến trình viêm IL-4, IL-12, IL-17, TNF-α, IFN-γ, tbet, CD80, CD85, CD86, hay thơng qua điều hịa biểu cytokine góp phần vào q trình điều biến miễn dịch IL-10, TGF-β, Indolamine-2,3-dioxygenase (IDO) Chỉ tiêu mức độ biểu gen gen cho thấy cải thiện xơ hóa nhóm chuột ghép tế bào Ngồi ra, tổng hợp Pro-collagen góp phần phản ánh lượng collagen xơ hóa Trong nghiên cứu này, ghi nhận giảm biểu Pro-collagen nhóm ADSC (giảm 2,08 lần); nhóm ADSC/HGF (giảm 3.03 lần); nhóm ADSC/HGF+PRP (giảm 8.53 lần) so với nhóm tiêm PBS (Hình 1C) Hình Biểu đồ kết hoạt độ ALT (A), số lượng bạch cầu tổng (B), mức độ biểu gen Pro-collagen (C) α-SMA (D) sau ngày điều trị nhóm tiêm PBS (PBS), ghép hADSC ni mơi trường ni cấy thơng thường (ADSC), mơi trường có bổ sung HGF (ADSC/HGF) mơi trường có bổ sung HGF kết hợp PRP (ADSC/HGF+PRP) Student’s t-test p < 0.05 (*: có ý nghĩa thống kê) 62 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Chỉ tiêu mô học Cải thiện cấu trúc mơ học (Hình 2) Cụ thể, dựa vào kết nhuộm H&E, nhận thấy số lượng tế bào gan bị hoại tử giảm đáng kể, kết tương thích với giảm hoạt độ men ALT Số lượng tế bào miễn dịch khơng cịn nhiều, cịn tập trung quanh vùng cửa, kết hoàn toàn phù hợp với giảm số bạch cầu tổng Sau ngày ghép x 105 tế bào, so với nhóm ADSC ADSC/HGF, nhóm ADSC/HGF+PRP có cải thiện xơ hóa nhiều thơng qua: Chỉ tiêu sinh hóa: giảm hoạt độ men ALT Chỉ tiêu mức độ biểu gen: giảm biểu gen Pro-collagen α-SMA Kỷ yếu khoa học Chỉ tiêu mô học: hồi phục cấu trúc mơ gan Điều giải thích tác động cộng gộp PRP HGF mơi trường ni cấy đến hADSC HGF góp phần kích thích di cư tế bào gốc mơ gan bị tổn thương, kết công bố tác giả Sabine Neuss vào năm 2004, Forte vào năm 2006, Sabrina Valente vào năm 2015 Đồng thời, theo công bố tác giả Asli Kocaoemer cộng vào năm 2007, PRP có khả kích thích việc trì tính gốc tế bào hADSC Khi tế bào hADSC trì tính gốc, chúng tăng cường biểu SOD MDA làm giảm gốc oxy hóa tự ROS, qua hạn chế hoại tử tế bào, làm giảm hoạt độ men ALT Hình Kết nhuộm H&E (20X) B’: Nhóm tiêm PBS (Nhóm PBS), C’: Nhóm ghép hADSC ni mơi trường ni cấy thơng thường (Nhóm ADSC), D’: Nhóm ghép hADSC ni mơi trường có bổ sung HGF (Nhóm ADSC/HGF), E’: Nhóm ghép hADSC ni mơi trường có bổ sung HGF kết hợp PRP (Nhóm ADSC/HGF+PRP) 63 Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Pro-collagen hay α-SMA hồi phục cấu trúc mô gan Trong nghiên cứu sâu hơn, đề nghị tiến hành nghiên cứu khả di cư hADSC ni cấy mơi trường có bổ sung HGF HGF kết hợp với PRP mô gan kĩ thuật đánh dấu tế bào ghép Lời cảm ơn Chúng xin chân thành cảm ơn tài trợ kinh phí từ chương trình “Vườn ươm sáng tạo khoa học công nghệ trẻ” thuộc Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ Chúng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Tế bào gốc (ĐHQG TP.HCM) tạo điều kiện để chúng tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết nghiên cứu tóm tắt sau: Sau ngày, liệu pháp ghép hADSC (5 x 105 tế bào) ni mơi trường có bổ sung HGF HGF kết hợp với PRP giúp cải thiện số cân nặng, giảm hoạt độ men ALT, giảm viêm thông qua giảm số lượng bạch cầu tổng, giảm biểu gen liên quan đến xơ hóa (Procollagen hay α-SMA), hồi phục cấu trúc mơ gan, so với nhóm chuột ghép hADSC nuôi cấy môi trường nuôi cấy thơng thường Trong đó, so với nhóm ADSC/HGF, chúng tơi ghi nhận nhóm ADSC/HGF+PRP có cải thiện số cân nặng, giảm hoạt độ men ALT, giảm biểu gen liên quan đến xơ hóa TÀI LIỆU THAM KHẢO SCHUPPAN, D AND N.H AFDHAL, "Liver Cirrhosis", Lancet, 371(9615): p 838-851, 2008 ORGANIZATION, W.H., VietNam: WHO statistical profile 2015, Retrieved 2016-04-11] Available at: http://www.who int/gho/countries/vnm pdf ZUK, P., "Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: a review", ISRN Stem Cells, 2013, 2013 BIEBACK, K., "Platelet Lysate as Replacement for Fetal Bovine Serum in Mesenchymal Stromal Cell Cultures", Transfusion Medicine and Hemotherapy, 40(5): p 326-335, 2013 RUBIO-AZPEITIA, E AND I ANDIA, "Partnership between platelet-rich plasma and mesenchymal stem cells: in vitro experience", Muscles, Ligaments and Tendons Journal, 4(1): p 52-62, 2014 GHARIBI, B AND F.J HUGHES, "Effects of medium supplements on proliferation, differentiation potential, and in vitro expansion of mesenchymal stem cells", Stem cells translational medicine, 1(11): p 771-782, 2012 ZHANG, J., S ZHOU, Y ZHOU, ET AL., "Hepatocyte growth factor gene-modified adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate radiation induced liver damage in a rat model", PLoS One, 9(12): p e114670, 2014 TRUONG, N.H., N.H NGUYEN, N.T.-K NGUYEN, et al., "Establishment of a standardized mouse model of hepatic fibrosis for biomedical research", Biomedical Research and Therapy, 1(02): p 43-49, 2014 64 ... pháp cấy ghép tế bào bao gồm cấy ghép tế bào gan, tế bào gốc từ gan tế bào gốc khơng thuộc gan Ngày nay, có nhiều nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị xơ gan tiến hành cách ứng dụng loại tế bào. .. hành cách ứng dụng loại tế bào gốc khác nhau: tế bào gốc phôi, tế bào gốc vạn cảm ứng, tế bào gốc trưởng thành Trong đó, tế bào gốc trung mô (MSC) - loại tế bào gốc trưởng thành, ứng dụng nhiều... ADSC điều trị xơ gan, có hai hướng chính: - Ghép trực tiếp tế bào gốc trung mô thu từ mô mỡ không qua nuôi cấy tăng sinh in vitro - Tiến hành nuôi cấy tăng sinh in vitro tế bào gốc trung mô thu