Nước ta đã cho phép trồng ngô biến đổi gen, tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi về mức độ an toàn của loại sản phẩm này. Hiện nay, việc phát hiện ngô biến đổi gen chủ yếu sử dụng phản ứng PCR để phát hiện sự hiện diện của promoter 35S. Bài viết bước đầu đã phát triển được bộ bít KIT có khả năng thực hiện phát hiện bắp biến đổi gen mà không cần sử dụng các thiết bị phức tạp của phòng thí nghiệm.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG BỘ KIT LAMP PHÁT HIỆN PROMOTER 35S Ở NGÔ CHUYỂN GEN Lê Hữu Triết*, Kiều Xuân Hương, Huỳnh Thị Thu Hà Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: lehuutriet.cntp@gmail.com TĨM TẮT Nước ta cho phép trồng ngô biến đổi gen, nhiên nhiều tranh cãi mức độ an toàn loại sản phẩm Hiện nay, việc phát ngô biến đổi gen chủ yếu sử dụng phản ứng PCR để phát diện promoter 35S Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi thiết bị luân nhiệt đắt tiền, tốn thời gian, phân tích phịng thí nghiệm nên hiệu sử dụng nhiều hạn chế Gần đây, kỹ thuật LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) phát triển để phát đoạn DNA đặc hiệu cách xác, nhanh chóng sử dụng thiết bị đơn giản khơng phụ thuộc nhiều vào thiết bị phịng thí nghiệm Ngồi ra, sản phẩm phản ứng LAMP quan sát trực tiếp, điều giúp việc phát bắp biển đổi gen trở nên đơn giản Do đó, thực đề tài “Bước đầu sản xuất thử nghiệm KIT phát promoter 35S bắp chuyển gen phương pháp LAMP” Trong nghiên cứu này, chúng tơi bước đầu phát triển bít KIT có khả thực phát bắp biến đổi gen mà không cần sử dụng thiết bị phức tạp phịng thí nghiệm Từ khóa: Ngơ, biến đổi gen, LAMP, PCR, Promoter 35S BUILDING KIT LAMP DETECTION OF PROMOTER 35S IN GENERAL TRANSMISSION Le Huu Triet*, Kieu Xuan Huong, Huynh Thi Thu Ha Ho Chi Minh City University of Food Industry *Corresponding Author: lehuutriet.cntp@gmail.com ABSTRACT Our country has allowed growing genetically modified corn, but there are seveal debate on the safety of this product At present, the detection of genetically modified corn is mainly using a PCR reaction to detect the existence of the promoter 35S However, this technique requires expensive and time-consuming thermal cycler, which is only analyzed in the laboratory, so the efficiency is limited Recently, the LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) technique has been developed to identify a specific DNA fragments accurately and rapidly by using simple equipment and not depend on laboratory equipment In addition, the product of LAMP can be observed directly, which is easier to detect transgenic corn Therefore, we conducted the study "Initial produced test kit KIT detects promoter 35S on corn by LAMP method" In this study, we have initially developed a KIT which is capableof detecting genetically modified corn without using complex laboratory equipment This result could create a great premise for the development of genetically modified corn KIT and could be applied in the market widely Keywords: Corn, genetically modified, LAMP, PCR, Promoter 35S 82 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học ngành công nghệ sinh học đặc biệt phương pháp dựa sở DNA Kỹ thuật PCR, Realtime-PCR, Quantitative RT-PCR, Multiplex PCR, Southern-Blot, LAMP,… Trong kỹ thuật LAMP (Loop mediated isothermal amplification) kỹ thuật nhân gen sử dụng nhiều để phân biệt thực phẩm GMO (Notomi cs., 2000) LAMP kỹ thuật khuyết đại đẳng nhiệt đoạn gen mục tiêu thời gian ngắn, có độ nhạy, độ xác cao giá thành rẻ ứng dụng thành công rộng rãi để phát loại sinh vật gây bệnh nhiều nơi giới Việt Nam (Nkouawa cs., 2009) Trong cơng nghệ gen thực vật, nói thành cơng sớm có giá trị lĩnh vực protein thực vật sử dụng promoter định có nguồn gốc từ virus vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu gen ngoại lai hiệu trồng biến đổi gen Rất nhiều promoter sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật tiến tục promoter lựa chọn nghiên cứu biểu nhanh, đơn giản rủi ro thấp (Lê Thị Thu Hiền cs., 2007) Đây chế thuận lợi nhận biết thực phẩm biến đổi gen, nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật nhân gen LAMP để phân biệt giống ngô biến đổi gen với ngô thường dựa vào promoter 35S, qua xây dựng kít giúp người sử dụng dễ dàng thực thao tác phát nhanh TỔNG QUAN Ngô (Zea mays L.,) đánh giá trồng có vai trị quan trọng cấu trồng nước ta với diện tích gieo trồng năm 2015 1179 nghìn ha, sản lượng đạt 4,6 triệu Tuy nhiên sản xuất ngô nước chưa đáp ứng đủ nhu cầu, hàng năm nước ta phải nhập lượng lớn ngơ từ nước ngồi Đối với ngơ chuyển gen Việt Nam, chưa có số liệu cụ thể tình hình nhập mặt hàng này, dù vậy, từ năm 2010 theo giải trình Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn thức cho phép trồng ngơ biến biến đổi gen Việt Nam 59 nước chấp nhận sử dụng thực phẩm biến đổi gen (Cao Đức Phát, 2011) Biến đổi gen (GMO - Genetic modification) kỹ thuật dùng phổ biến công nghệ DNA tái tổ hợp thực cách đưa gen ngoại lai vào genome sinh vật đích làm thay đổi gen nội sinh vật Cơng nghệ biến đổi gen đạt nhiều thành tựu trong số trồng chứa gen Bt (ngô Bt, Bt, đậu tương Bt,…) kháng lại sâu hại chúng có chứa protein loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Chen cs., 2008) Tuy nhiên, GMO tạo cách chuyển gen lạ vào hệ genome vật chủ, GMO ln chứa thơng tin di truyền từ lồi lạ nên người sử dụng sinh phản ứng protein tạo từ gen lạ hay cịn gọi dị ứng protein Vì vậy, nhiều quốc gia yêu cầu dán nhãn bao bì thực phẩm có nguyên liệu từ sinh vật biến đổi gen để người tiêu dùng nhà sản xuất có quyền lựa chọn Việc phân tích phát thực phẩm biến đổi gen trở nên dễ dàng dựa vào phát triển VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống ngô chuyển gen NK67 BT/GT chứa gen Cry1Ab công ty TNHH 83 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học LAMP không hoạt động riêng lẻ phản ứng PCR mà chúng kết hợp với để bắt cặp với DNA mục tiêu khuếch đại tạo thành DNA Kết điện di sản phẩm phản ứng LAMP khảo sát nồng độ hai cặp primer F3/B3, FIP/BIP cho thấy, tất nghiệm thức xuất band vạch Hiện band vạch rõ giếng (FIP/BIP: 0,6 µM, F3/B3: 0,2 µM), giếng (FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM ) giếng 10 (FIP/BIP: 0,6 µM, F3/B3: 0,4 µM) Vậy theo kết thí nghiệm này, tơi chọn nồng độ primer tối ưu là: FIP/BIP: 0,8 µM, F3/B3: 0,2 µM (giếng số 4) Kết phù hợp với nghiên cứu nồng độ primer kỹ thuật LAMP công bố trước (Zhou cs., 2009) Xác định nhiệt độ khuếch đại phù hợp Nhiệt độ yếu tố quan trọng phản ứng LAMP định khả primer bắt cặp chuyên biệt với mạch khuôn DNA cách đặc hiệu Nhiệt độ cung cấp phụ thuộc vào đặc tính enzyme Bst, đặc tính primer Có thể kết luận nhiệt độ tối ưu để thực phản ứng LAMP khoảng nhiệt độ từ 62oC đến 67oC Kết thu đuợc có tương đồng so sánh kết với nghiên cứu trước (Zhen cs., 2016) khảo sát phản ứng LAMP với nhiệt độ tối ưu (61oC, 63oC, 65oC) Xác định ngưỡng phát LAMP với promoter 35S Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá độ nhạy phương pháp LAMP diện promoter 35S Cho thấy nghiệm thức xuất các band vạch kết tương tự với nghiên cứu (Zahradnik cs., 2014) Vậy phản ứng LAMP, cần nồng độ DNA 12,5 ng/µl thực phản ứng Khi so sánh độ nhạy Syngenta Việt Nam Phương pháp nhiên cứu DNA ngô ly trích theo ba phương pháp: (1) Quy trình ly trích sử dụng CTAB (Bùi Minh Trí Bùi Cách Tuyến, 2003) có chỉnh sửa bổ sung; (2) Quy trình KIT thương mại; (3) Quy trình ly trích DNA trực tiếp sử dụng NaOH Sau DNA định tính định lượng DNA máy đo quang phổ UV-Vis 660 điện di gel agarose Phản ứng LAMP tối ưu theo thông số: Tỷ lệ tối ưu cặp primer LAMP, nhiệt độ tối ưu phản ứng LAMP từ 62oC đến 67oC nồng độ DNA Thiết kế bình gia nhiệt di động cho phản ứng LAM nhằm thay cho máy luân nhiệt PCR đảm bảo thiết kế nhỏ gọn, dễ dàng sử dụng tính linh hoạt cao Sau sử dụng tiến hành dùng thuốc nhuộm SYBR (Invitrogen, Mỹ) để phát sản phẩm khuếch đại ánh sáng cực tím (UV) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết ly trích DNA Sau thực ly trích DNA, kết điện di cho thấy thực ly trích DNA quy trình CTAB KIT thương mại thu band vạch DNA sáng, thẳng rõ ràng Trong đó, ly trích quy trình NaOH khơng thấy xuất DNA, hàm lượng DNA ly trích quy tình thấp nên khơng không xuất kết điện di Để tiết kiệm chi phí nghiên cứu, chúng tơi sử dụng DNA ly trích từ quy trình CTAB để thực phản ứng khảo sát Tối ưu hóa quy trình LAMP Xác định nồng độ cặp primer Trong phản ứng LAMP, việc tối ưu hóa nồng độ primer có vai trị quan trọng, primer phản ứng 84 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 phản ứng LAMP phản ứng PCR, lượng DNA mẫu tương đương sản phẩm phản ứng LAMP rõ phản ứng PCR Như vậy, phản ứng LAMP có độ nhạy việc khuếch đại đoạn DNA đặc trưng tốt phản ứng PCR kết tương tự nghiên cứu trước Phát sản phẩm LAMP thuốc nhuộm SYBR Kết cho thấy khả sử dụng thuốc nhuộm SYBR có khả phát trực tiếp sản phẩm khuếch đại kỹ thuật LAMP Kết có tiềm lớn việc áp dụng trực tiếp ngồi thực tế khơng bị phụ thuộc vào thiết bị phịng thí nghiệm hệ thống điện di, hệ thống chụp gel Ngồi giúp góp phần rút ngắn thời gian thực thông qua việc giảm bước điện di chụp hình Đây ưu điểm lớn kỹ Kỷ yếu khoa học thuật LAMP đề cập nghiên cứu trước KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, ly trích thành cơng DNA mẫu ngơ, hồn thiện quy trình phát ngơ biến đổi gen thơng qua xác định có mặt promoter 35S kỹ thuật LAMP với thông số tối ưu: Nồng độ, nhiệt độ ngưỡng khuếch đại Chúng thiết kế thành cơng bình ổn nhiệt di động dễ dàng sử dụng, vận chuyển, sạc pin nhanh gọn, dễ bảo trì, thuận lợi cho mơi trường làm việc khác Sử dụng thành công thuốc nhuộm SYBR phát trực tiếp sản phẩm khuếch đại kỹ thuật LAMP tia UV Chúng tiếp tục nghiên cứu để hồn thiện quy trình để áp dụng rộng rãi thực tế TÀI LIỆU THAM KHẢO BÙI MINH TRÍ & BÙI CÁCH TUYẾN, 2003 Xây dựng quy trình chẩn đóa n bắp có chuyển gene kháng sâu (CryIA [b]) gene tăng cường chuyển hóa đường (Invertase) kỹ thuật PCR Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp, CAO ĐỨC PHÁT, 2011 Cây trồng biến đổi gen Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 2940 CHEN, M., ZHAO, J Z., COLLINS, H L., EARLE, E D., CAO, J & SHELTON, A M, 2008 A critical assessment of the effects of Bt transgenic plants on parasitoids PLoS One, 3, e2284 LÊ THỊ THU HIỀN, TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN & NÔNG VĂN HẢI, 2007 Promoter ứng dụng công nghệ Gen thực vật Tạp chí cơng nghệ sinh học, 5, 1-18 NKOUAWA, A., SAKO, Y., NAKAO, M., NAKAYA, K & ITO, A, 2009 Loop-mediated isothermal amplification method for differentiation and rapid detection of Taenia species Journal of Clinical Microbiology, 47, 168-74 85 ... đổi gen, nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật nhân gen LAMP để phân biệt giống ngô biến đổi gen với ngô thường dựa vào promoter 35S, qua xây dựng kít giúp người sử dụng dễ dàng thực thao tác phát. .. biến đổi gen (Cao Đức Phát, 2011) Biến đổi gen (GMO - Genetic modification) kỹ thuật dùng phổ biến công nghệ DNA tái tổ hợp thực cách đưa gen ngoại lai vào genome sinh vật đích làm thay đổi gen nội... đổi gen để người tiêu dùng nhà sản xuất có quyền lựa chọn Việc phân tích phát thực phẩm biến đổi gen trở nên dễ dàng dựa vào phát triển VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống ngô chuyển