Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng và nhiều ứng dụng trong y học. Bài viết tiến hành xây dựng một phương pháp luận dựa trên sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh các mẫu nấm kí sinh côn trùng tại Langbian nói chung và Việt Nam nói riêng.
Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP LUẬN HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM CORDYCEPS VÀ CÁC CHI LÂN CẬN BẰNG PHÁT SINH CHỦNG LOÀI PHÂN TỬ ĐA GEN (ON THE FIRST STEPS TOWARDS A METHODOLOGY TO ASSIST IN THE IDENTIFICATION OF CORDYCEPS AND RELATED FUNGI BY MULTIGENE PHYLOGENETICS) Trịnh Văn Hạnh, Ngơ Thị Diệp, Nguyễn Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Thu Thảo, Lao Đức Thuận* Khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh SUMMARY A methodology was created to assist in the identification process of entomopathogenic fungi (Cordyceps, Clavicipitaceae), a genus with a diverse species content and therapeutic applications The method was formed from creating a reference dataset to assist in the identification process of several samples (1) The dataset includes database of nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Tub and Atp6 for related fungi; (2) Gene sequences obtained from fungal samples of Lang Bian, Lam Dong through DNA extraction by phenol/chloroform method with the assist of β-mercaptoethanol and CTAB; (3) Molecular phylogenies were analyzed on single gene and multigene trees by MEGA 6.0 software with different tree construction methods (Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Maximum Likelihood (ML) Boostrapping was included to support tree branches The molecular method with the combination of molecular biology and bioinformatics was completely in agreement with morphological-based methods As a result, DL0038A and DL0038B were reconfirmed as Cordyceps takaomontana (Anamorphic form: Isaria tenuipes), DL004 was reconfirmed asCordyceps neovolkiana.DL0067 was in a very close relationship or is Isaria tenuipes, DL0075 was in a very close relationship or is Cordyceps staphylinicola DL0069 and DL0077 were in a very close relationship with Simplicillium lamellicola or Simplicillium lanosoniveum Keywords: Molecular phylogenetics, Cordyceps, Clavicipitaceae, Entomopathogenic fungi MỞ ĐẦU Chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps (họ Clavicipitaceae), tiêu biểu có Cordyceps sinensis, chứa nhiều thành phần hoạt chất quan trọng nhiều ứng dụng y học[3] Hiện nay, nghiên cứu không tập trung vào lồi Cordyceps sinensis mà cịn mở rộng nghiên cứu đến nhiều loài thuộc họ Clavicipitaceae, loài cho có hoạt tính y dược q C sinensis[4] Tuy nhiên, việc định danh loại nấm thuộc chi dựa phân tích hình thái Kobayashi(1982)(được xem tiêu chuẩn vàng định danh) gặp nhiều khó khăn chi nấm (1) đa dạng đặc điểm, cấu trúc loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, (2) hệ thống định danh nhóm nấm tồn thể lưỡng danh hữu tính (teleomorph) vơ tính (anamorph) gây phức tạp hóa q trình định danh[3] Vì vậy, việc xây dựng phương pháp luận dựa việc phân tích phát sinh lồi phân tử nhằm hỗ trợ cho cơng tác định danh nấm tiến hành Phương pháp luận xây dựng dựa sinh học phân tử kết hợp với tin sinh học ứng dụng việc xây dựng phát sinh sinh Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 loài đơn gen hay đa gen Nền tảng phương pháp luận (1) sinh học phân tử (gồm chủ yếu PCR điện di giải trình tự) (2) tin sinh học (gồm xây dựng sở dự liệu (CSDL), xây dựng phát sinh loài phân tử).Trên giới, việc nghiên cứu phát sinh loài ứng dụng hỗ trợ định danh nấm ký sinh côn trùng nghiên cứu trước đây, chẳng hạn Sung et al (2007) sử dụng liệu – gen bao gồm nrSSU, nrLSU, rpb1, rpb2, Atp6, tub tef1 để tiến hành phân tích, nghiên cứu sâu quan hệ chi thuộc họ Clavicipitaceae, kết nghiên cứu tái xếp lại chi liên quan Bộ liệu công bố Sung et al (2007) dẫn liệu đối chứng phát sinh lồi mà xây dựng Thông tin cho thấy kết hợp đa gen góp phần hỗ trợ làm tăng mức độ tin cậy phát sinh loài q trình định danh nấm ký sinh trùng (Sung et al., 2007) Trong nghiên cứu này, Chúng tiến hành xây dựng phương pháp luận dựa sinh học phân tử kết hợp tin sinh học để định danh mẫu nấm kí sinh trùng Langbian nói chung Việt Nam nói riêng Đồng thời phương pháp luận kiểm định mẫu nấm kí sinh trùng định danh hình thái gồm: DL004: Cordyceps nevolkiana, DL0038A: Cordyceps takaomontana, DL0038B: Cordyceps takaomontana, DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium sp., DL0075: Cordyceps sp., DL0077: Simphicillium sp (Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Nguyên, 2015) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Kế thừa kết nghiên cứu trước nhóm TS Trương Bình Ngun TS Đinh Minh Hiệp (2005), công bố sử dụng mẫu nấm phân thành nhóm gồm (1) DL004, DL0038A, DL0038B nhóm định danh hình thái đến mức lồi, xem nhóm đối chứng để kiểm tra phương pháp luận mà nhóm xây dựng; đặc biệt nhóm này: hai mẫu nấm DL0038A DL0038B hai mẫu định danh đến mức lồi hình thái, hỗ trợ từ phân tích trình tự ITS chưa đạt kết mong muốn (2) DL0067, DL0069, DL0075 DL0077 định danh hình thái đến mức chi, nhóm sử dụng với mục đích từ kết định danh phân tử hỗ trợ thêm thơng tin cho định danh hình thái Tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch đại gen mục tiêu Quy trình tách chiết DNA từ hệ sợi nấm thực phương pháp Phenol/Chloroform, theo Chomczynski Sacchi (1987) có biến đổi cho phù hợp với mục tiêu thu nhận DNA (thay đổi số pH phenol từ thành 8) bổ sung thêm chất bổ trợ β-mercaptoethanol CTAB Phản ứng PCR thực máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao gồm 95 ºC phút (1 chu kỳ), 40 chu kỳ lặp lại với 95 ºC - 30 giây, X ºC - 30 giây, 72 ºC - phút 72 ºC - phút (1 chu kỳ) (X nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho gen nrLSU: 55oC, nrSSU: 42,5oC, Tef1: 55oC, Rpb1: 46,3oC, Tub: 58,5oC, Atp6: 43oC) Thể tích phản ứng 25 µl bao gồm: 12,5 µl buffer PCR, 0,5 µl mồi xi ngược, µl ddH2O µl DNA Sản phẩm PCR tiến hành điện di gel agarose % tiến hành giải trình tự cơng ty Nam Khoa Mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự mồi sử dụng cho phản ứng PCR, cung cấp IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ) Hiệu chỉnh trình tự, xây dựng phát sinh lồi Sản phẩm PCR sau giải trình tự chiều kiểm tra phần mềm Chromas Lite phiên 2.1.1 hai chiều hiệu chỉnh cẩn thận thông qua phần mềm Seaview, BioEdit, BLAST, … Các trình tự sau hiệu chỉnh gióng cột đồng hóa với liệu tham chiếu thu nhận từ công trình tác giả Sung et al Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 (2007) Cuối cùng, liệu tiến hành dị tìm mơ hình tiến hóa phù hợp theo chuẩn Bayesian Information Criterion (BIC) phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013) Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA phiên 6.0 (Tamura et al., 2013) Các phương pháp sử dụng để xây dựng phát sinh loài bao gồm: Neighbor joining (NJ), Maximum parsimony (MP) Maximum likelihood (ML) mơ hình tiến hóa phù hợp từ kết dị tìm phần mềm MEGA 6.0; Cây phát sinh loài đánh giá phương pháp bootstrap lặp lại 1000 lần với mức đạt ý nghĩa giá trị ủng hộ lớn 50 so sánh mặt địa hình học (Topology) với phát sinh loài tham chiếu Sung et al (2007) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách chiết DNA, PCR gen mục tiêu Xây dựng thành cơng quy trình tác chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm phương pháp phenol/Chloroform có bổ sung βmercaptoethanol CTAB cho kết tối ưu, nồng độ DNA cao (kết khơng trình bày) Chúng tơi tiến hành tối ưu hóa thành cơng quy trình PCR nhiệt độ bắt cặp cho gene đại diện hình Hình Điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU, Rpb1, Tef1 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% cho kết băng sản phẩm trùng khớp với kết khảo sát in silico tham khảo từ cơng trình nghiên cứu Sung et al (2007) cụ thể kích thước 950, 1102, 803 1040 nucleotides, tương ứng với gen nrLSU, nrSSU,rpb1 tef1 (Sung et al., 2007) Xây dựng phát sinh loài Các gen sau hiệu chỉnh tiến hành đồng hóa với sở liệu tham chiếu gen nrLSU, nrSSU, rpb1 tef1, Atp6, Tub xây dựng dựa cơng trình nghiên cứu Sung et al (2007) Các phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA 6.0 gồm NJ, MP, ML dựa liệu tham chiếu đơn gen mẫu nấm cho kết mặt địa hình học (Topology) tương ứng với (dữ liệu khơng trình bày) Tuy nhiên nhằm tăng hiệu phân tích, việc ghép gen với làm tăng chiều dài trình tự giúp tăng độ xác, thơng qua thơng số phát sinh chủng loài giá trị ràng buộc (bootstrap), đơn vị đo khoảng cách biến đổi (substitution) đồng quan điểm với nhiều cơng trình nghiên cứu khác giới, chẳng hạn nghiên cứu Sung et al (2007), Johnson et al (2009), Chan et al (2011) Phương pháp luận hỗ trợ định danh tái kiểm tra với kết định danh hình thái với mẫu định danh đến mức loài Cụ thể mẫu DL004, DL0038A, DL0038B Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL004 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Dựa phát sinh loài cho mẫu DL004 (Hình: 3), cho thấy địa hình học NJ, MP, ML tương tự mẫu DL004 phân nhóm với trình tự tham chiếu Ophiocordyceps neovolkiana (HQ215593, HM852531) với giái trị bootstrap đạt 100/100/94 NJ/MP/ML Giá trị bootstrap > 70% tương ứng với giá trị xác xuất > 95% giá trị phân nhóm ủng hộ mạnh mẽ[2] Dựa hình thái mẫu DL004 định danh Cordyceps neovolkiana (Lê et al., 2010) Như vậy, Kết phân tích phân tử mẫu DL004 trùng khớp với kết định danh hình thái, mẫu DL004 kết luận Cordyceps neovolkiana Mẫu DL0038A, DL0038B xây dựng phát sinh lồi đa gen ln phân nhóm với Isaria tenuipes (thể vơ tính Cordyceps takaomontana)[6] với giá trị bootstrap ủng hộ mạnh mẽ cho phân nhóm 98/99/95 NJ, MP, ML Về hình thái, mẫu DL0038A, DL0038B định danh Cordyceps takaomontana (Lê et al., 2010) Kết định danh phân tử mẫu tương đồng phù hợp với định danh hình thái, mẫu DL0038A DL0038 kết luận Cordyceps takaomontana (thể vơ tính Isaria tenuipes) Từ kết trên, phương pháp luận mà xây dựng lần tái kiểm tra cho thấy kết định danh phân tử hoàn toàn ủng hộ kết định danh hình thái Kết kiểm định giúp cung cấp thêm sở khoa học cho phương pháp luận xây dựng hướng đến ứng dụng định danh mẫu nấm khác, đặc biệt chi nấm Cordyceps chi lân cận Đối với mẫu DL0067, DL0069, DL0075, DL0077 định danh hình thái đến mức chi Cụ thể, mẫu DL0067 xây dựng phát sinh loài đơn gen đa gen ln phân nhóm với trình tự tham chiếu Isaria tenuipes giá trị bootstrap ủng hộ cao cho phân nhóm Khi xây dựng phát sinh lồi đa gen mẫu DL0067 lại phân nhóm với DL0038A với giá trị bootstrap NJ/MP/ML 100/100/100 mẫu nấm phân nhóm với Isaria tenuipes thuộc ngân hàng giống OSC111005 với giá trị bootstrap 98/99/95 NJ/MP/ML Kết phát sinh lồi đơn đa gen mẫu DL0067 định danh phân tử Isaria tenuipes (thể vơ tính Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 Cordyceps takaomontana) Hiện mẫu DL0067 tiếp tục ni cấy phịng thí nghiệm với mong muốn thu nhận thể để có thêm thơng tin định danh dựa hình thái Kết hợp với định danh hình thái mẫu DL0067 Isaria sp (Lê et al., 2010) định danh phân tử cho kết đến mức loài Isaria tenuipes giúp cung cấp thêm thông tin để hỗ trợ nhóm nghiên cứu định danh sau Như vậy, kết luận mẫu DL0067 Isaria sp có quan hệ gần lồi Isaria tenuipes Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Về hình thái, tương tự mẫu DL0067 hai mẫu DL0069, DL0077 định danh đến mức chi Simplicillium (Lê et al., 2010) Mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phát sinh lồi đơn gen ln phân nhóm với Simplicillium lamellicola (CBS 116.25) Simplicillium lanosoniveum (CBS 101267) chi Simplicillium với giá trị bootstrap ủng hộ cho phân nhóm mức ý nghĩa (kết khơng trình bày) Kết hợp với phát sinh lồi đa gen gen nrLSU, nrSSU, rpb1, Tef1 phân nhóm Simplicillium với thơng số bootstrap NJ/MP/ML 100/90/99.Như vậy, kết luận mẫu DL0069, DL0077 loài thuộc chi Simplicillium sp có quan hệ gần với lồi Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum Hình Một phần phả hệ phân tử mẫu DL0069, DL0077 xây dựng phương pháp MP (Các số hiển thị NJ/MP/ML, bootstrap = 1000 lần) Trường hợp mẫu DL0075 tiến hành xây dựng đơn gen đa gen ln phân nhóm với trình tự tham chiếu Cordyceps staphylinidicola với giá trị bootstrap ủng hộ cao cho phân nhóm đa gen NJ/MP/ML 100/100/100 Về mặt hình thái mẫu DL0075 định danh tới mức chi Cordyceps sp.Vì vậy, chúng tơi kết luận mẫu DL0075 lồi thuộc Cordyceps sp có quan hệ gần lồi Cordyceps staphylinidicola Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 KẾT LUẬN Phương pháp luận dựa việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử - kết hợp với tin sinh học xây dựng thành cơng hỗ trợ định danh lồi nấm ký sinh côn trùng Phương pháp khẳng định tái kiểm tra mẫu DL004, DL0038A, DL0038B Kết định danh phân tử hoàn tồn trùng khớp với kết định danh hình thái, mẫu kết luận DL0038, DL0038B Cordyceps takaomontana - thể hữu tính Isaria tenuipes - thể vơ tính DL004 là Cordyceps neovolkiana Đối với mẫu nấm chưa thể định danh đến mức lồi dựa hình thái, kết định danh dựa phân tử cho thấy: mẫu DL0067 định danh loài thuộc Isaria sp có quan hệ gần lồi Isaria tenuipes DL0075 nhận định loài thuộc Cordyceps sp có quan hệ gần lồi Cordyceps staphylinidicola Mẫu DL0069, DL0075 nhận định loài thuộc Simplicillium sp có quan hệ gần với loài Simplicillium lamellicola hay Simplicillium lanosoniveum Kết định danh cung cấp cho thêm nhiều thông tin sở khoa học cho công tác định danh dựa hình thái sau TÀI LIỆU THAM KHẢO Andreas, D, B, Ouellette, B, F, Bioinfomatics A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Methods of Biochemical Analysis, Vol 43, pp 323-359 Capote, N., Pastrana, A, M, Aguado, A, and Torres, P, S, 2012.Molecular Tools for Detection of Plant Pathogenic Fungi and Fungicide Resistance, Plant Pathology, InTech Chan, W, H, Ling, K, H, Chiu, S, W, et al (2011), Molecular Analyses of Cordyceps gunnii in China, J Food & Drug Anal 19: 18-25 Cummings; John, N, 2009 Entomopathogenic fungi in New Zealand native forests : the genera Beauveria and Isaria, Biological Sciences, 10 Đinh Minh Hiệp, Trương Bình Ngun, 2015.Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps Tây Nguyên khảo sát tiềm ứng dụng chúng y dược,Báo cáo tổng kết nghiệm thu đề tài Sở Khoa Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Kobayasi, Y, 1982.Keys to taxa of genera Cordyceps and Torrubiella, Transactions of the mycological society of Japan; Vol 23, 329-364 Sung, G, H,; Jones, N, L, H; Jae, M, S,; Luangsaard, J, J,; Shrestha, B,; Spatafora, J, W, 2007 Phylogenetic classification of Cordycepsand the clavicipitaceous fungi, Studies in Mycology; Vol 57; pp.5-59 Sung, G, H, Sung, J, M, Hywel-Jones, N, L, Spatafor, J, W, 2007.A multi-gene phylogeny of Clavicipitaceae (Ascomycota, Fungi):Identification of localized incongruence using a combinational bootstrap approach, Molecular Phylogenetics and Evolution ... loài đơn gen hay đa gen Nền tảng phương pháp luận (1) sinh học phân tử (gồm chủ yếu PCR điện di giải trình tự) (2) tin sinh học (gồm xây dựng sở dự liệu (CSDL), xây dựng phát sinh loài phân tử) .Trên... KẾT LUẬN Phương pháp luận dựa việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử - kết hợp với tin sinh học xây dựng thành công hỗ trợ định danh lồi nấm ký sinh trùng Phương pháp khẳng định tái kiểm tra mẫu. .. hình thái Kết kiểm định giúp cung cấp thêm sở khoa học cho phương pháp luận xây dựng hướng đến ứng dụng định danh mẫu nấm khác, đặc biệt chi nấm Cordyceps chi lân cận Đối với mẫu DL0067, DL0069,