Nghiên cứu tiến hành khảo sát tác động của cao chiết gừng được chiết xuất bằng ba phương pháp: ngâm dầm (G1), Soxhlet (G3) và siêu âm (G5) lên tế bào ung thư gan HepG2 nuôi cấy dạng 3D. Sự tác động của cao chiết gừng trên tế bào HepG2 được đánh giá bằng các phương pháp đánh giá hình thái spheroid, xác định đường cong tăng trưởng, xác định tỷ lệ tế bào chết.
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CAO CHIẾT GỪNG LÊN SỰ TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ GAN HEPG2 Ở ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 3D Đinh Thị Thùy Dương* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: dinhduong0508@gmai.com TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành khảo sát tác động cao chiết gừng chiết xuất ba phương pháp: ngâm dầm (G1), Soxhlet (G3) siêu âm (G5) lên tế bào ung thư gan HepG2 nuôi cấy dạng 3D Sự tác động cao chiết gừng tế bào HepG2 đánh giá phương pháp đánh giá hình thái spheroid, xác định đường cong tăng trưởng, xác định tỷ lệ tế bào chết Cao chiết có hoạt tính mạnh đánh giá khả gây chết theo chu trình tế bào phương pháp chạy Flow cytometry Kết cho thấy cao chiết G3 có hoạt tính mạnh tế bào HepG2 (giá trị IC50 G3 299,3±8,358 µg/ml so với G1=341±3,93 µg/ml G5=487,3±39,97 µg/ml) Đặc biệt, cao chiết G3 gây độc tế bào mạnh thơng qua q trình kích hoạt apoptosis Từ khóa: Cao chiết gừng, ngâm dầm, Soxhlet, siêu âm, ung thư gan, HepG2, apoptosis STUDYING THE EFFECT OF GINGER EXTRACT ON HUMAN LIVER CANCER CELL LINE HEPG2 IN 3D CULTURE SYSTEM Dinh Thi Thuy Duong* University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: dinhduong0508@gmai.com ABSTRACT This study aims to test the effect of ginger extract on human liver cancer cell line HepG2 in 3D culture system Ginger extract is purified by three different methods including maceration (G1), Soxhlet (G3) and sonication (G5) The effect of ginger extract on HepG2 cell line is tested by three different ways including evaluation of spheroid morphology, determination of the growth curve and cell death rate The results show that G3 has highest extraction efficiency and is the most effective inhibitor on HepG2 IC50 value of G3 is lowest with 299,3± 8,358 µg/ml (in comparison to 341,7±9,395 µg/ml of G1 and 487,3±39,97 µg/ml of G5) Especially, we demonstrated that the effect of G3 is through inhibition of cellular growth via apoptosis pathway Keywords: Ginger extract, maceration, Soxhlet, sonication, liver cancer, HepG2, apoptosis vùng có tỷ lệ ung thư gan cao, ước tính trung bình năm nước có 10.000 ca ung thư gan phát Trong năm gần đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh ung thư TỔNG QUAN Bệnh ung thư nói chung ung thư gan nói riêng vấn đề ngày quan tâm hầu hết quốc gia giới Việt Nam quốc gia nằm 96 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 gan ngày tăng có xu hướng trẻ hóa Mặc dù có nhiều thuốc liệu pháp điều trị phát triển, song hiệu điều trị giới hạn với tượng kháng thuốc, di tái phát khối u Do nghiên cứu sàng lọc thuốc có nguồn gốc thiên nhiên cần thiết giai đoạn Gừng (Zingiber officinale Roscoe) loại thảo dược trồng phổ biến Việt Nam, chứng minh có chứa nhiều chất chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn đặc biệt có tác dụng chống ung thư Trong đó, việc sàng lọc thuốc dùng mơ hình tế bào ni cấy lớp đơn (Two dimensional 2D) Việc nuôi cấy lớp đơn làm thay đổi nhiều đặc tính tế bào, thể chưa xác đặc điểm tế bào ung thư khối u, thuốc sàng lọc tạo từ mơ hình mang lại hiệu không cao Nuôi cấy 3D (Three dimensional) đời nhằm giải vấn đề giảm thiểu sử dụng động vật làm thí nghiệm Mơi trường ni cấy 3D tốt việc giúp tế bào tái cấu trúc sinh lý chức mô sống Với ưu điểm này, việc sử dụng mơ hình ni cấy 3D đáp ứng đầy đủ yêu cầu cần thiết cho việc sàng lọc phát triển loại thuốc điều trị ung thư Kỷ yếu khoa học sạch, xay nhỏ Phương pháp nghiên cứu Phương pháp ngâm dầm Ngâm 100g gừng tươi băm nhỏ 500ml ethanol, dung môi ngấm dần vào gừng hòa tan chất tan ethanol Sau 72 giờ, tiến hành lọc thu dịch chiết Phương pháp Soxhlet Chiết xuất 20g gừng tươi băm nhỏ với 100ml ethanol hệ thống Soxhlet Phương pháp siêu âm trình chiết xuất hỗ trợ máy siêu âm với 100g gừng tươi 500ml ethanol Quá trình siêu âm tiến hành nhiệt độ 15oC thời gian 30 phút Kết thúc trình siêu âm tiến hành lọc thu dịch chiết (dịch chiết thu từ phương pháp ngâm dầm, Soxhlet, siêu âm tiến hành đông khô để loại bỏ dung môi) Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng Tế bào sau ngày tạo mơ hình 3D xử lý với cao chiết gừng G1, G3, G5 với nồng độ 2000 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 60 µg/ml, 30 µg/ml, 15 µg/ml Sau 48 xử lý thuốc, tiến hành nhuộm AlamarBlue, sau đo kết máy DTX 880 Tín hiệu huỳnh quang đo dùng bước sóng kích thích 535nm đo bước sóng phát xạ 620nm Phương pháp nhuộm PI (Propidium iodide) Tế bào HepG2 sau 48 xử lý cao chiết G1, G3 G5 với nồng độ 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg /ml, 125 µg/ml, 60 µg/ml, 30 µg/ml nhuộm PI (Propidium iodide) PI phát huỳnh quang màu đỏ, kích thích bước sóng từ 400-600 nm phát ánh sáng từ 600-700 nm Sau ủ 10 phút tủ ni, chụp hình tế bào kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp phân tích tế bào theo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Dịng tế bào ung thư biểu mơ gan HepG2 cung cấp Viện Tế bào Gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM Tạo mơ hình tế 3D tế bào HepG2 đĩa Hanging Drop với mật độ 2500 tế bào/giếng Gừng tươi mua Đắc Nông, mẫu phân lập, loại bỏ phần hư, rửa 97 Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học tế bào HepG2 Đối chứng với Doxorubicin cho kết IC50 = 402,3 nM Kết nhuộm PI Tại nồng độ 30 µg/ml, 60 µg/ml, 125 µg/ml tác động không đáng kể dường không chênh lệch ba phương pháp, nồng độ 500 µg/ml 1000 µg/ml tế bào gần chết hoàn tồn Đặc biệt, G3 nồng độ 250 µg/ml gây chết phần lớn tế bào, chứng tỏ G3 có tác động gây chết tế bào HepG2 mạnh Việc đánh giá quần thể tế bào chết theo chương trình tiến hành tế bào HepG2 xử lý cao chiết G3 với nồng độ dựa kết IC50 (299,3± 8,358 µg/ml) từ thí nghiệm trước Theo đó, tế bào HepG2 xử lý cao chiết G3 với nồng độ gấp lần IC50 (1200 µg/ml), gấp lần IC50 (600 µg/ml), IC50 (300 µg/ml), nửa IC50 (150 µg/ml) Cao chiết gừng G3 làm chết tế bào HepG2 theo đường apoptosis tác động cao chiết lên tế bào tăng dần theo nồng độ Kết tương đối phù hợp với nghiên cứu Vijaya Padma cộng (năm 2007), nghiên cứu chiết xuất gừng gây q trình apoptosis lên tế bào gan HepG2 dịng chảy Flow cytometry (FCM) Được tiến hành tế bào HepG2 xử lý với cao chiết có tác động ức chế tế bào HepG2 tốt nhất, với nồng độ dựa kết IC50 từ thí nghiệm trước Dựa vào tín hiệu thuốc nhuộm PI AnnexinV để kết luận tình trạng quần thể tế bào Phân tích thống kê số liệu Các số liệu xử lý thống kê phần mềm GraphPad Prism 7, khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p