NGHIÊN cứu tác ĐỘNG của NANO bạc và NANO sắt lên CHẤT LƯỢNG cây GIỐNG IN VITRO ở một số cây TRỒNG có GIÁ TRỊ KINH tế

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA NANO BẠC VÀ NANO SẮT LÊN CHẤT LƯỢNG CÂY GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY TRỒNG CĨ GIÁ TRỊ KINH TẾ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Dương Tấn Nhựt PGS.TS Trương Thị Bích Phượng Hoc viên thực hiện: Đỗ Mạnh Cường Thừa Thiên Huế - 2022 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BIỂU ĐỒ xiv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vi nhân giống 1.1.1 Khái niệm vi nhân giống 1.1.2 Các giai đoạn vi nhân giống thực vật 1.1.2.1 Khử trùng bề mặt 1.1.2.2 Phát sinh hình thái 1.1.2.3 Cây hồn chỉnh thích nghi vườn ươm 12 1.1.3 Một số hạn chế vi nhân giống thực vật 13 1.1.3.1 Tích luỹ khí ethylene 13 1.1.3.2 Hoá nâu mẫu cấy 15 Nano kim loại 16 1.2.1 Giới thiệu chung 16 1.2.2 Ứng dụng nano kim loại vi nhân giống thực vật 17 1.2.3 AgNPs FeNPs vi nhân giống thực vật 19 1.2.3.1 AgNPs vi nhân giống thực vật 19 v 1.2.3.2 FeNPs vi nhân giống thực vật 22 1.2.3.3 Hấp thu, vận chuyển chuyển hóa nano kim loại 25 1.2.4 Tính an tồn sinh học nano kim loại 27 Sơ lược đối tượng trồng sử dụng nghiên cứu 28 1.3.1 Cây salem 28 1.3.2 Dâu tây 29 1.3.3 Sâm Ngọc Linh 31 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 Vật liệu 34 2.1.1 Vật liệu thực vật 34 2.1.2 Dung dịch nano 34 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 34 Nội dung nghiên cứu 35 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy 35 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu ni cấy in vitro 35 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro35 2.2.4 Nghiên cứu khả sinh trưởng in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 36 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 36 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy36 vi 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu ni cấy in vitro 37 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hồn chỉnh từ chồi ni cấy in vitro 38 2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Theo dõi khả thích nghi, sinh trưởng, phát triển tích luỹ hoạt chất in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 40 2.3.2 Phương pháp theo dõi tiêu 41 2.3.3 Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo 42 2.3.4 Phương pháp giải phẫu thực vật 42 2.3.5 Phương pháp quan sát đếm số lượng tế bào 42 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene 43 2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ 43 2.3.8 Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1) 44 Điều kiện nuôi cấy 44 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm 44 Phương pháp xử lý thống kê 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy 46 3.1.1 Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu salem 46 3.1.2 Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu dâu tây 49 vii 3.1.3 Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu sâm Ngọc Linh 52 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu nuôi cấy in vitro 57 3.2.1 Ảnh hưởng AgNPs lên gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo salem nuôi cấy in vitro 57 3.2.2 Ảnh hưởng AgNPs lên tái sinh chồi từ huyền phù tế bào salem nuôi cấy in vitro 60 3.2.3 Ảnh hưởng AgNPs lên q trình phát sinh tăng sinh phơi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 62 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hồn chỉnh từ chồi ni cấy in vitro 68 3.3.1 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi salem nuôi cấy in vitro68 3.3.2 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hồn chỉnh từ chồi dâu tây ni cấy in vitro 71 3.3.3 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 74 Khả sinh trưởng in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 84 3.4.1 Khả sinh trưởng salem in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 84 3.4.2 Khả sinh trưởng dâu tây in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro viii 87 3.4.3 Khả sinh trưởng sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 98 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 101 PHỤ LỤC ix MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Công nghệ sinh học thực vật - đặc biệt phương pháp nuôi cấy tế bào, mô quan thực vật môi trường dinh dưỡng kiểm sốt - khắc phục khó khăn phương pháp nhân giống truyền thống [101] Ưu điểm phương pháp tạo số lượng lớn trồng đồng mặt di truyền, tạo nguồn giống bệnh, bảo tồn phát triển nguồn gene nghiên cứu đặc tính sinh lý thực vật Nuôi cấy mô, tế bào quan thực vật bao gồm cảm ứng mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh phôi, tái sinh chồi, hình thành rễ, Sự thành cơng phương pháp phụ thuộc vào số yếu tố kiểu gene, loại mẫu cấy, phương pháp khử trùng bề mặt, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hồ sinh trưởng thực vật, hệ thống ni cấy, quang chu kỳ, Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm mang lại phương pháp cịn tồn số hạn chế trình khử trùng bề mặt mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệu tái sinh, hiệu q trình phát sinh hình thái khơng cao, tích luỹ khí ethylene ảnh hưởng đến hiệu nhân giống, chất lượng giống tỷ lệ sống sót hoá vườn ươm thấp, giá thành giống cao [84], [40] Do việc ứng dụng nguồn vật liệu cải tiến môi trường điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao chất lượng giống mục tiêu vi nhân giống thương mại Chúng ta sống thời đại mà công nghệ nano ứng dụng nhiều lĩnh vực vật lý, hoá học, điện tử, môi trường, lượng, vật liệu, sinh học [108] Trong năm gần đây, tương tác vật liệu nano với thực vật thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Rất nhiều nghiên cứu tác động loại hạt nano lên hệ thống thực vật tiến hành Các nhà nghiên cứu cho thấy thành phần, cấu trúc, nồng độ hạt nano có ảnh hưởng tích cực tiêu cực khác đến sinh trưởng, phát triển thực vật [85] Tác động tích cực đáng kể hạt nano lên thực vật chứng minh thông qua khả gia tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng cường sinh trưởng hoạt động sinh lý, ngăn ngừa bệnh hại, sản sinh ethylene rụng quan sinh sản, tăng sản lượng suất trồng tăng cường chuyển hóa hợp chất thứ cấp có giá trị dược phẩm, chất dinh dưỡng hóa chất nơng nghiệp [178], [135], [66] Từ đó, loạt ứng dụng thương mại hóa liên quan tới việc triển khai hạt nano nông nghiệp phát triển cách nhanh chóng để cải thiện chất lượng trồng, hạn chế việc sử dụng dư thừa thuốc trừ sâu, phân bón hóa học Song song với việc sử dụng hệ thống nuôi cấy tiên tiến ni cấy mơ tế bào thực vật (hệ thống thống khí, bioreactor, vi thủy canh, hệ thống chiếu sáng đơn sắc,…) nhằm cải thiện điều kiện nuôi cấy để khắc phục số hạn chế tồn vi nhân giống thường quy, hạt nano bắt đầu đầu tư nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng cao việc kháng khuẩn cải thiện chất lượng giống (khả hấp thu ánh sáng, tăng cường quang hợp, điều khiển sinh trưởng, phát triển thực vật) [155] Chính vậy, để hiểu rõ vai trò tiềm nano việc khử trùng, bổ sung chất điều hoà sinh trưởng thay dinh dưỡng khoáng nhằm cải thiện nhược điểm hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng giống nuôi cấy mô, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tác động nano bạc nano sắt lên chất lượng giống in vitro số trồng có giá trị kinh tế” Trong nghiên cứu này, trồng sử dụng làm đối tượng nghiên cứu salem (Limonium sinuatum) loài hoa cắt cành phổ biến, dâu tây (Fragaria × ananassa) - ăn trái có giá trị kinh tế gắn liền với du lịch thành phố Đà Lạt sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) - loài dược liệu đặc hữu Việt Nam Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát Đề tài thực nhằm đánh giá tác động hạt nano bạc (AgNPs) sử dụng khử trùng bề mặt mẫu bổ sung vào môi trường nuôi cấy, hạt nano sắt (FeNPs) - sử dụng thay sắt-Ethylenediamine Tetra Acetate (FeEDTA) trình vi nhân giống lên chất lượng giống số loại trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây sâm Ngọc Linh) Mục tiêu cụ thể Đánh giá ảnh hưởng AgNPs lên hiệu khử trùng bề mặt mẫu salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh so sánh với chất khử trùng truyền thống [calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], chlorua thủy ngân (HgCl2)] Đánh giá ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái (phát sinh phơi, tái sinh chồi, gia tăng số lượng tế bào) salem, dâu tây sâm Ngọc Linh Đánh giá ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình hình thành hồn chỉnh salem, dâu tây sâm Ngọc Linh Đánh giá ảnh hưởng AgNPs hấp thu đến biến động khí ethylene tích luỹ q trình hình thành rễ salem, dâu tây sâm Ngọc Linh Đánh giá khả thích nghi sinh trưởng salem, dâu tây sâm Ngọc Linh giai đoạn ex vitro có nguồn gốc từ nghiệm thức tốt AgNPs FeNPs nuôi cấy in vitro Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy), FeNPs (thay Fe-EDTA môi trường nuôi cấy) với nồng độ khác sử dụng để nghiên cứu khả khử trùng, sinh trưởng, phát triển nâng cao chất lượng giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên giai đoạn khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái vi nhân giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên giai đoạn tạo hoàn chỉnh ba đối tượng trồng (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh) nuôi cấy in vitro Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị vai trị nano kim loại đến trình khử trùng bề mặt, sinh trưởng, phát triển, biến động khí ethylene nâng cao chất lượng giống vi nhân giống hoa cảnh, ăn trái dược liệu Luận án nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu giảng dạy lĩnh vực vi nhân giống thực vật Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu luận án có nhiều tiềm ứng dụng sản xuất giống thương mại Những đóng góp luận án Đây cơng trình Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) vi nhân giống salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh Đề tài đánh giá vai trò AgNPs ức chế khí ethylene nhằm nâng cao chất lượng giống salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Bổ sung nano kim loại vào môi trường nuôi cấy giai đoạn vi nhân giống giúp gia tăng khả thích nghi tỷ lệ sống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh giai đoạn vườn ươm Xây dựng quy trình nhân giống ba loại trồng có giá trị kinh tế cao salem, dâu tây sâm Ngọc Linh ảnh hưởng nano kim loại CCC 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 DTL 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 TLT 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 CHLL 1,00 Duncan a 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Bảng 3.12 Kết phân tích thống kê đặc điểm salem bịch nhựa sau 12 tuần nuôi trồng CCC 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 TLDT 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 NF1 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 NF2 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 DTL 1,00 Duncan a 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 KLT 1,00 Duncana 2,00 3,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Bảng 3.13 Kết phân tích thống kê đặc điểm sâm Ngọc Linh vỉ xốp sau tháng nuôi trồng TLS 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 SL ,00 Duncana 5,60 1,20 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 CCC ,00 Duncana 5,60 1,20 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 DTL ,00 Duncana 5,60 1,20 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 KLT ,00 Duncana 5,60 1,20 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 CHLL ,00 Duncana 5,60 1,20 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Bảng 3.14 Kết phân tích thống kê đặc điểm sâm Ngọc Linh rổ nhựa sau 18 tháng nuôi trồng SL 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 CCC Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 DTL 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 KLT 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 CHLL 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Biểu đồ 3.5 Kết phân tích thống kê khối lượng tươi củ sâm Ngọc Linh nhà kính sau 24 tháng ni trồng KLT 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Biểu đồ 3.6 Kết phân tích thống kê hàm lượng saponin củ sâm Ngọc Linh nhà kính sau 24 tháng nuôi trồng SPN1 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 SPN2 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 SPN3 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 SPN4 1,00 Duncana 3,00 2,00 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 Dựa kết nghiên cứu trên, quy trình nhân giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh mơi trường có diện AgNPs, FeNPs đề xuất sau: Khử trùng bề mặt salem ex vitro Mơ sẹo ½ MS + 1,0 mg/L Picloram môi trường lỏng 20 ngày 1,2 mg/L AgNPs Ni cấy huyền phù tế bào salem ½ MS + 1,0 mg/L Zeatin tuần 1,6 mg/L AgNPs Tái sinh chồi salem MS + 0,4 mg/L NAA tuần 0,4 mg/L AgNPs Ra rễ salem 4, 12 tuần Cây có nguồn gốc từ nghiệm thức có bổ sung 0,4 mg/L AgNPs Thích nghi, sinh trưởng, phát triển hoa điều kiện vườn ươm Sơ đồ 3.1 Quy trình nhân giống salem có diện AgNPs nồng độ thời gian thích hợp Khử trùng bề mặt dâu tây ex vitro MS + 1,0 mg/L TDZ + 0,1 mg/L IBA MS + 0,4 mg/L NAA tuần 0,5 mg/L AgNPs 1,4 mg/L FeNPs Ra rễ dâu tây 4, 12 tuần Cây có nguồn gốc từ nghiệm thức thay 1,4 mg/L FeNPs Thích nghi, sinh trưởng, phát triển, hoa, đậu tạo ngó điều kiện vườn ươm Sơ đồ 3.2 Quy trình nhân giống dâu tây có diện AgNPs FeNPs nồng độ thời gian thích hợp Khử trùng bề mặt sâm Ngọc Linh ex vitro ½ MS + 1,0 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ tuần 0,2 mg/L AgNPs 20 phút Mô sẹo MS + 1,0 mg/L 2,4-D + 0,5 mg/L NAA + 0,2 mg/L Kin 14 tuần 1,6 mg/L AgNPs Phát sinh tăng sinh phôi sâm Ngọc Linh SH + 1,0 mg/L NAA 12 tuần 1,2 mg/L AgNPs Ra rễ sâm Ngọc Linh tháng, năm, năm Cây có nguồn gốc từ nghiệm thức có bổ sung 1,2 mg/L AgNPs Thích nghi, sinh trưởng, phát triển tích luỹ saponin hoa điều kiện vườn Sơ đồ 3.3 Quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh có diện hạt nano kim loại thích hợp ... tài ? ?Nghiên cứu tác động nano bạc nano sắt lên chất lượng giống in vitro số trồng có giá trị kinh tế? ?? Trong nghiên cứu này, trồng sử dụng làm đối tượng nghiên cứu salem (Limonium sinuatum) loài... số lượng tế bào từ mô sẹo salem nuôi cấy in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên tái sinh chồi từ huyền phù tế bào salem nuôi cấy in vitro Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khả phát sinh tăng sinh... (số lượng tế bào tăng lên theo hàm số mũ) Sau giai đoạn tăng trưởng giai đoạn cân bằng, sinh trưởng tế bào diễn ổn định, số lượng tế bào sinh số lượng tế bào chết Cuối giai đoạn suy vong, sinh