NGHIÊN cứu tác ĐỘNG của NANO bạc và NANO sắt lên CHẤT LƯỢNG cây GIỐNG IN VITRO ở một số cây TRỒNG có GIÁ TRỊ KINH tế

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ***** ĐỖ MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA NANO BẠC VÀ NANO SẮT LÊN CHẤT LƯỢNG CÂY GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thừa Thiên Huế - 2021 Cơng trình hồn thành tại: Phịng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Dương Tấn Nhựt PGS.TS Trương Thị Bích Phượng Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Du Sanh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP Hồ Chí Minh Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Đình Thi, Trường Đại học Nơng Lâm, Đại học Huế Phản biện 3: TS Huỳnh Văn Biết, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp vào hồi………giờ……… ngày…… tháng…… năm…… Có thể tìm hiểu luận án tại: MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Công nghệ sinh học thực vật - đặc biệt phương pháp nuôi cấy tế bào, mô quan thực vật môi trường dinh dưỡng kiểm sốt - khắc phục khó khăn phương pháp nhân giống truyền thống Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm mang lại phương pháp tồn số hạn chế trình khử trùng bề mặt mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệu tái sinh, hiệu q trình phát sinh hình thái khơng cao, tích luỹ khí ethylene ảnh hưởng đến hiệu nhân giống, chất lượng giống tỷ lệ sống sót hố vườn ươm thấp, giá thành giống cao Do việc ứng dụng nguồn vật liệu khử trùng cải tiến môi trường nhằm nâng cao chất lượng giống mục tiêu vi nhân giống thương mại Chúng ta sống thời đại mà công nghệ nano ứng dung nhiều lĩnh vực vật lý, hố học, điện tử, mơi trường, lượng, vật liệu, sinh học Chính vậy, để hiểu rõ vai trò tiềm nano việc khử trùng, bổ sung chất điều hồ sinh trưởng thay dinh dưỡng khống nhằm cải thiện nhược điểm hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng giống nuôi cấy mô, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu tác động nano bạc nano sắt lên chất lượng giống in vitro số trồng có giá trị kinh tế” Trong nghiên cứu này, trồng sử dụng làm đối tượng nghiên cứu salem (Limonium sinuatum), dâu tây (Fragaria × ananassa) sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Mục tiêu đề tài Đề tài thực nhằm đánh giá tác động hạt nano bạc (AgNPs) - sử dụng khử trùng bề mặt mẫu bổ sung vào môi trường nuôi cấy, hạt nano sắt (FeNPs) - sử dụng thay sắtEthylenediamine Tetra Acetate (Fe-EDTA) trình vi nhân giống lên chất lượng giống số loại trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây sâm Ngọc Linh) Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy), FeNPs (thay Fe-EDTA môi trường nuôi cấy) với nồng độ khác sử dụng để nghiên cứu khả khử trùng, sinh trưởng, phát triển nâng cao chất lượng giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên giai đoạn khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái vi nhân giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên giai đoạn tạo hoàn chỉnh ba đối tượng trồng (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh) nuôi cấy in vitro Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị vai trị nano kim loại đến q trình khử trùng bề mặt, sinh trưởng, phát triển, biến động khí ethylene nâng cao chất lượng giống vi nhân giống hoa cảnh, ăn trái dược liệu Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết nghiên cứu luận án có nhiều tiềm ứng dụng sản xuất giống thương mại Những đóng góp luận án Đây cơng trình Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) vi nhân giống salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh Đề tài đánh giá vai trò AgNPs ức chế khí ethylene nhằm nâng cao chất lượng giống salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Bổ sung nano kim loại vào môi trường nuôi cấy giai đoạn vi nhân giống giúp gia tăng khả thích nghi tỷ lệ sống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh giai đoạn vườn ươm Xây dựng quy trình nhân giống ba loại hoa cảnh có giá trị kinh tế cao salem, dâu tây sâm Ngọc Linh ảnh hưởng nano kim loại Kết cấu luận án Luận án gồm 125 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành phần: Phần mở đầu trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu 29 trang; Chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 12 trang; Chương 3: Kết bàn luận 52 trang; Phần kết luận đề nghị trang; Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án trang; Phần tài liệu tham khảo 24 trang với 180 tài liệu tham khảo tiếng Việt, tiếng Anh Luận án có 20 bảng, 20 hình biểu đồ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 10 vấn đề với nội dung liên quan đến: (1) Vi nhân giống; (2) Các trình vi nhân giống; (3) Hạn chế vi nhân giống; (4) Nano kim loại; (5) Ứng dụng nano kim loại; (6) Nano bạc nano sắt vi nhân giống thực vật; (7) Tính an tồn sinh học nano kim loại; (8) Sơ lượt salem; (9) Sơ lượt dâu tây; (10) Sơ lượt sâm Ngọc Linh Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu thực vật Lá non salem (Limonium sinuatum) dâu tây (Fragaria × ananassa) tháng tuổi, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) năm tuổi 2.1.2 dung dịch nano AgNPs có kích thước 20 – 25 nm, FeNPs có kích thước 20 – 60 nm 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất Thiết bị dụng cụ: Cân điện tử, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy đo hàm lượng diệp lục SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Nhật Bản), tủ sấy Sanyo MOV-112, tủ sấy Memmert, cân kỹ thuật Prescisa (Nhật Bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm 365 nm, ẩm kế (JR-900A, Trung Quốc), máy lắc Hermle (Ðức), kính hiển vi soi C-BD230 CH30RF200, kính hiển vi điện tử huỳnh quang, kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800, máy quang phổ hấp phụ AAS-6650, máy sắc ký khí GC-CP 3380, đèn cồn, dao cấy, đĩa cấy, panh cấy, kéo, bình ni cấy, dây thun, nylon, găng tay, Hố chất: Agar, gelrite (Việt Xơ, Cty Phan Trần, Hồ chí Minh); sucrose (Biên Hồ, Đồng Nai); hố chất sử dụng môi trường MS SH, chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Merck, Sigma, Duchefa) 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu ni cấy in vitro 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro 2.2.4 Nghiên cứu khả sinh trưởng in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu salem Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu dâu tây Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu sâm Ngọc Linh 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu ni cấy in vitro Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên hình thành huyền phù tế bào từ mô sẹo salem nuôi cấy in vitro Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên tái sinh chồi từ huyền phù tế bào salem ni cấy in vitro Thí nghiệm 2.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên trình phát sinh tăng sinh phơi vơ tính từ mơ sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi ni cấy in vitro Thí nghiệm 3.1 Khảo sát ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hồn chỉnh từ chồi salem ni cấy in vitro Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi dâu tây nuôi cấy in vitro Thí nghiệm 3.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Theo dõi khả thích nghi, sinh trưởng, phát triển tích luỹ hoạt chất in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Thí nghiệm 4.1: Theo dõi khả thích nghi, sinh trưởng phát triển salem in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Thí nghiệm 4.2: Theo dõi khả thích nghi, sinh trưởng phát triển dâu tây in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Thí nghiệm 4.3: Theo dõi khả thích nghi, sinh trưởng, phát triển tích luỹ hoạt chất sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 2.3.2 Phương pháp theo dõi tiêu 2.3.3 Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo 2.3.4 Phương pháp giải phẩu thực vật 2.3.5 Phương pháp quan sát đếm số lượng tế bào 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene 2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ 2.3.8 Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1) 2.4 Điều kiện nuôi cấy 2.5 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm 2.6 Phương pháp xử lý thống kê Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy 3.1.1 Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu salem Sau tuần nuôi cấy, kết ghi nhận cho thấy mẫu khử trùng 0,2 g/L AgNPs 20 phút 0,5 g/L 15 phút cho tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ cảm ứng mô sẹo khối lượng tươi tối ưu nghiệm thức khác (Bảng 3.1 Hình 3.1) Bảng 3.1 Ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu salem sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ Nồng Thời Chất khử nhiễm độ gian trùng hoại (g/L) (phút) tử (%) 100,00a* 10 100,00a 0,05 15 72,22b AgNPs 20 71,11b Tỷ lệ tái Khối sinh mô lượng sẹo (%) tươi (g) 27,77e 28,88e 0,52e 0,53de 30 73,33b 26,66e 0,54cd a 100,00 b e 10 70,00 30,00 0,53de 0,1 15 68,89b 31,11e 0,54cd c d 20 46,66 53,33 0,64b b e 30 71,11 28,88 0,55c b e 71,11 28,89 0,54cd c d 10 45,55 54,44 0,64b de bc 15 36,66 63,33 0,73a 0,2 20 26,66f 73,33a 0,74a b e 30 70,00 30,00 0,53de 71,11b 28,89e 0,52e cd cd 10 44,44 55,55 0,65b f a 0,5 15 26,66 73,33 0,73a e b 20 35,55 64,44 0,73a 30 68,89b 31,11e 0,53de cde bcd HgCl2 43,33 56,66 0,64b Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể nghiệm thức khơng có mẫu thành cơng Hình 3.1 Sự cảm ứng khác mẫu salem khử trùng AgNPs so với HgCl2 sau tuần nuôi cấy a: mẫu khử trùng 0,2 g/L AgNPs 20 phút; b: mẫu khử trùng 0,2 g/L AgNPs 30 phút c: mẫu khử trùng g/L HgCl2 phút; sau tuần ni cấy Hình 3.3 Sự cảm ứng khác mẫu sâm Ngọc Linh khử trùng AgNPs so với HgCl2 sau 1, 2, tuần nuôi cấy a, b, c, d: mô sẹo nghiệm thức khử trùng 0,2 g/L AgNPs 20 phút sau 1, 2, tuần nuôi cấy; e: Các mô phôi hình cầu (quan sát kính hiển vi điện tử: SEM) nghiệm thức khử trùng 0,2 g/L AgNPs 20 phút sau tuần nuôi cấy; f: mô sẹo nghiệm thức khử trùng HgCl2 sau tuần nuôi cấy 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên phát sinh hình thái loại mẫu nuôi cấy in vitro 3.2.1 Ảnh hưởng AgNPs lên gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo salem nuôi cấy in vitro Sau ngày nuôi cấy, tế bào trải qua giai đoạn thích nghi (tế bào sinh trưởng chậm) Giai đoạn tăng trưởng tế bào kéo dài từ ngày nuôi cấy thứ đến ngày thứ 12 tất nồng độ AgNPs ngày thứ 16 đối chứng Giai đoạn ổn định nồng độ AgNPs ngày thứ 12, đối chứng ngày thứ 16 kéo dài đến ngày thứ 20 Sau đó, số lượng tế bào giảm nhanh đến ngày thứ 24 giảm chậm đến ngày 28, điều chứng tỏ tế bào bước vào giai đoạn suy vong (Biểu đồ 3.1 Hình 3.4) 12 60000 Số lượng tế bào 50000 40000 30000 20000 10000 Thời gian mg/L AgNPs 12 ngày 16 ngày 20 ngày 24 ngày 28 ngày 751 1086 3673 16337 19361 14639 12008 0,4 mg/L AgNPs 989 1251 31543 33385 34228 21321 19964 0,8 mg/L AgNPs 902 1419 35517 40463 43639 25963 22406 1,2 mg/L AgNPs 1350 1623 45850 48433 49088 26294 22858 1,6 mg/L AgNPs 1020 1433 39529 41909 43989 24041 21623 mg/L AgNPs 700 1299 31416 38630 43254 21611 17049 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng AgNPs lên gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo salem sau 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ngày ni cấy Hình 3.4 Huyền phù tế bào từ mô sẹo salem môi trường nuôi cấy lỏng lắc a, b, c: huyền phù tế bào môi trường không bổ sung AgNPs giai đoạn thích nghi (ngày thứ 8), tăng trưởng (ngày thứ 16), suy vong (ngày thứ 24); d, e, f: huyền phù tế bào môi trường bổ sung 13 AgNPs nồng độ 1,2 mg/L giai đoạn thích nghi (ngày thứ 8), tăng trưởng (ngày thứ 16), suy vong (ngày thứ 24) 3.2.2 Ảnh hưởng AgNPs lên tái sinh chồi từ huyền phù tế bào salem nuôi cấy in vitro Sau tuần nuôi cấy, kết ghi nhận cho tỷ lệ mẫu tái sinh, chiều cao chồi, số chồi lớn 1,5 cm, khối lượng tươi nghiệm thức 1,6 mg/L AgNPs đạt cao so với nghiệm thức lại Số chồi bình đạt cao 0,8 mg/L AgNPs chồi dính liền với khơng thể tách rời (Bảng 3.4 Hình 3.5) Bảng 3.4 Ảnh hưởng AgNPs lện tái sinh, sinh trưởng phát triển chồi từ huyền phù tế bào salem sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ Chiều Số chồi > Khối AgNPs Số mẫu tái cao chồi 1,5 lượng (mg/L) chồi/bình sinh (%) (cm) cm/bình tươi (g) b* c b d 0,0 40,00 2,33 0,90 0,00 0,21c ab bc b c 0,4 45,55 3,00 1,06 1,33 0,31bc 0,8 47,77ab 6,66a 1,20b 2,00bc 0,42b ab bc ab b 1,2 59,99 4,00 1,33 2,33 0,42b a b a a 1,6 67,77 4,66 1,83 3,66 0,65a a bc ab b 2,0 66,66 3,66 1,26 2,33 0,32bc Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan Hình 3.5 Sự tái sinh, sinh trưởng phát triển chồi từ huyền phù tế bào salem đối chứng nồng độ AgNPs khác sau tuần nuôi cấy 14 a, b, c, d, e, f: chồi salem từ môi trường bổ sung nồng độ AgNPs khác (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; từ trái qua phải) sau tuần ni cấy 3.2.3 Ảnh hưởng AgNPs lên q trình phát sinh tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Sau 14 tuần nuôi cấy, kết ghi nhận cho thấy số phơi/bình, có nguồn gốc từ phơi, lớn cm/bình, khối lượng tươi khối lượng khơ đạt cao nghiệm thức bổ sung 1,6 mg/L AgNPs (Bảng 3.5 Hình 3.6, 3.7) Bảng 3.5 Ảnh hưởng AgNPs lên khả nhân nhanh phôi tái sinh chồi từ phơi vơ tính sâm Ngọc Linh sau tuần ni cấy Cây có nguồn Khối Khối gốc từ phôi AgNPs Số phôi/ lượng lượng khơ (mg/L) bình tươi cây Cây > Tổng (g) (mg) cm/bình 0,0 40,33c* 4,33d 2,66c 0,28c 28,66d c b bc bc 0,4 49,33 9,33 4,00 0,35 43,33bcd 0,8 83,66b 9,66b 5,00ab 0,63a 56,33bc b b ab ab 1,2 98,33 10,66 5,33 0,56 62,00b a a a abc 1,6 140,00 14,66 5,66 0,48 86,00a c c d bc 2,0 40,66 6,66 0,00 0,31 41,00cd Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 15 Hình 3.6 Ảnh hưởng Hình 3.7 Hình thái phơi vơ tính AgNPs lên q trình sinh tăng sâm Ngọc Linh đối chứng sinh phôi soma sâm Ngọc Linh 1,6 mg/L AgNPs sau 14 nuần nuôi cấy a: phơi vơ tính từ mơi trường a b Phôi soma chụp không bổ sung AgNPs (đối kính hiển vi huỳnh quang chứng) sau tuần ni cấy; b, c, phơi hình cầu bề mặt mơ d: phơi vơ tính từ mơi trường bổ sẹo lấy kính hiển vi sung 1,6 mg/L AgNPs sau tuần điện tử quét (SEM môi nuôi cấy trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau tuần ni cấy, c Phơi soma lấy kính hiển vi huỳnh quang môi trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau tuần nuôi cấy, d Phôi soma môi trường chứa 1,6 mg/L AgNPs sau 14 tuần nuôi cấy 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro 3.3.1 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi salem nuôi cấy in vitro Sau tuần nuôi cấy, kết ghi nhận cho thấy nghiệm thức bổ sung 0,4 mg/L AgNPs cho chiều cao cây, chiều rộng lá, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô, Chlorophyll tối ưu so với nghiệm thức lại Ở nghiệm thức thay Fe-EDTA 2,8 mg/L FeNPS cho tiêu theo dõi thấp so với 0,4 mg/L AgNPs tương đồng so với đối chứng (Bảng 3.6) Bảng 3.6 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hoàn chỉnh từ chồi salem sau tuần nuôi cấy Nano (mg/L) AgNPs FeNPs Tỷ lệ rễ (%) Chiều cao (cm) Chiều rộng (cm) 16 Chiều dài rễ (cm) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (mg) Chlorophyll (nmol/cm2) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 - 0,0 0,7 1,4 2,8 5,6 8,4 11,2 100,00a* 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 6,36b 8,43a 6,56b 5,33de 5,16e 5,10e 5,00e 5,36cde 6,20bc 6,10bcd 5,40cde 5,36cde 0,56b 0,56b 0,93a 1,03a 1,16a 1,20a 0,36b 0,36b 0,56b 0,53b 0,53b 0,50b 0,66b 0,96a 1,03a 0,56bcd 0,40cd 0,50bcd 0,43bcd 0,53bcd 0,63bc 0,43bcd 0,40cd 0,36d 1,74b 2,36a 1,24c 1,02cde 0,86de 0,81e 1,28c 1,30c 1,77b 1,20cd 1,31c 1,31c 94,87b 108,17a 80,58c 76,22c 75,51c 63,58d 75,95c 76,70c 95,91b 80,77c 79,77c 79,17c 22,36b 26,90a 21,40bc 18,86bcd 18,20cd 16,50d 18,90bcd 19,49bcd 21,23bc 20,76bc 19,77bcd 19,13bcd Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 3.3.2 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi dâu tây nuôi cấy in vitro Sau tuần nuôi cấy, kết ghi nhận nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/L AgNPs thay Fe-EDTA 1,4 mg/L FeNPs cho tỷ lệ rễ, chiều cao cây, số rễ, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô, chlorophyll tối ưu so với nghiệm thức lại (Bảng 3.7) Bảng 3.7 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên trình tạo hoàn chỉnh từ chồi dâu tây sau tuần nuôi cấy Nano (mg/L) AgNPs FeNPs Tỷ lệ rễ (%) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 - 0,0 0,7 1,4 2,8 5,6 11,2 71,11bc* 78,89ab 65,55bcd 58,89cd 52,22d 56,67cd 88,89a 61,11cd 51,11d 32,22e Chiều cao (cm) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (mg) Chlrophyll (nmol/cm2) 3,96b 4,63b 6,75a 4,72ab 3,49b 5,56ab 6,76a 5,36ab 4,10b 3,60b 2,66bcd 5,00ab 4,00abc 4,33abc 6,33a 2,00cd 4,00abc 2,66bcd 2,33cd 0,66d 3,10ab 1,60bc 5,13a 4,46a 0,96c 3,60ab 4,46a 3,16ab 1,96bc 1,93bc 0,30bcd 0,46b 0,71a 0,44b 0,26cd 0,32bcd 0,75a 0,37bc 0,19d 0,18d 40,10d 80,61ab 65,19c 73,35bc 38,98de 72,68bc 84,19a 76,61ab 37,98de 30,13e 27,40c 34,49ab 30,31bc 29,98bc 28,44bc 25,32cd 38,31a 29,16bc 24,11cd 20,57d Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 17 3.3.3 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro Sau 12 tuần nuôi cấy, kết ghi nhận cho thấy nghiệm thức bổ sung 1,2 mg/L AgNPs cho chiều cao cây, số rễ, đường kính củ, chiều dài củ, khối lượng tươi, chlorophyll tối ưu so với nghiệm thức lại Ở nghiệm thức thay Fe-EDTA 5,6 mg/L FeNPs cho tiêu theo dõi cao so với nghiệm thức khác (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Ảnh hưởng AgNPs FeNPs lên q trình tạo hồn chỉnh từ chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần nuôi cấy Nano (mg/L) AgNPs FeNPs Tỷ lệ rễ (%) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 - 0,0 0,7 1,4 2,8 5,6 11,2 100,00a* 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a 100,00a Chiều cao (cm) Số rễ Đường kính củ (cm) Chiều dài củ (cm) Khối lượng tươi (g) Chlorophyll (nmol/cm2) 3,93bc 4,33bc 5,31b 6,75a 3,89bc 3,39c 5,16ab 5,33ab 6,56a 4,26bc 2,93c 2,66df 4,33cde 6,33b 8,66a 4,66bcd 6,00bc 4,33cde 5,33bcd 3,66def 5,00bcd 2,33f 0,43e 0,70bc 0,86b 1,16a 0,73bc 0,66bcd 0,46de 0,53cde 0,60cde 0,86b 0,53cde 1,53c 1,46c 2,03b 2,43a 2,40a 2,53c 1,60c 1,63c 1,66c 1,93b 1,66c 0,86bc 1,19abc 1,31ab 1,56a 1,25abc 0,89bc 0,76c 1,11abc 1,20abc 1,32ab 0,73c 18,90bcd 19,70bcd 21,10bc 26,56a 18,80bcd 16,93cde 14,13e 15,90de 17,03cde 21,76b 9,60f Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 3.4 Khả sinh trưởng in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro 3.4.1 Khả sinh trưởng salem in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Sau 12 tuần nuôi trồng kết cho thấy có nguồn gốc từ mơi trường bổ sung 0,4 mg/L AgNPs giai đoạn tạo 18 hoàn chỉnh cho tỷ lệ sống sót, số lá, chiều cao cây, diện tích lá, khối lượng tươi cây, hàm lương chlorophyll, số cành, chiều cao hoa, số lượng dé cành, số lượng hoa dé, khối lượng tươi hoa đạt tối ưu so với nghiệm thức khác (Bảng 3.9, 3.10, Hình 3.11) Bảng 3.9 Khả thích nghi sinh trưởng salem vĩ xốp sau tuần nuôi trồng Nano (mg/L) AgNPs 0,0 0,4 - FeNPs 0,0 2,8 Tỷ lệ sống (%) 71,33b 89,00a 72,00b Chiều cao (cm) 6,96b 9,83a 7,10b Số 3,66c 10,00a 5,66b Diện tích (cm2) 4,03b 14,75a 8,26b Khối lượng tươi (g) 2,50b 4,23a 2,73b Chlorophyll (nmol/cm2) 25,76b 35,26a 28,46b Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan Bảng 3.10 Khả sinh trưởng phát triển salem chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng Nano (mg/L) AgNPs FeNPs 0,0 0,4 - 0,0 2,8 Số lượng cành 10,66c 16,66a 14,33b Chiều cao hoa (cm) 46,00c 85,00a 62,00b Số lượng dé/cành 66,00b 88,66a 71,33b Số lượng hoa/dé 2,33b 4,33a 2,66b Khối lượng tươi hoa (g) 28,93c 61,53a 35,26b Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 3.4.2 Khả sinh trưởng dâu tây in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Sau 12 tuần nuôi trồng kết cho thấy có nguồn gốc từ mơi trường thay Fe-EDTA 1,4 mg/L FeNPs giai đoạn tạo hoàn chỉnh cho tỷ lệ sống, số lá, chiều cao cây, diện tích 19 lá, khối lượng tươi cây, hàm lương chlorophyll, tỷ lệ đậu trái, số lượng ngó F1, F2 đạt tối ưu so với nghiệm thức khác (Bảng 3.11, 3.12, Hình 3.12) Bảng 3.11 Khả thích nghi sinh trưởng dâu tây vĩ xốp sau tuần nuôi trồng Nano (mg/L) FeNPs AgNPs 0,0 0,5 - 0,0 1,4 Tỷ lệ sống (%) 69,33b 72,33b 86,00a Số 6,00b 6,33b 8,66a Chiều cao (cm) 6,66b 7,33b 11,33a Diện tích (cm2) 1,94b 2,06b 3,24a Khối lượng tươi (g) 5,46b 5,83b 8,86a Chlorophyll (nmol/cm2) 33,53b 35,03b 39,90a Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan Bảng 3.12 Khả sinh trưởng phát triển dâu tây chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng Nano (mg/L) FeNPs AgNPs 0,0 0,5 - 0,0 1,4 Chiều cao (cm) 10,30b 11,40b 15,01a Tỷ lệ đậu trái (%) 50,00b 76,66a 81,76a Số lượng ngó F1 2,00b 3,00b 6,00a Số lượng ngó F2 0,00b 0,00b 3,00a Diện tích (cm2) 7,33b 8,22b 14,00a Khối lượng tươi (g) 21,80b 22,83b 39,86a Ghi chú: *Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan 3.4.3 Khả sinh trưởng sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy môi trường bổ sung AgNPs thay Fe-EDTA FeNPs tối ưu giai đoạn ex vitro Sau 6; 12; 24 tháng nuôi trồng kết cho thấy có nguồn gốc từ mơi trường bổ sung 1,2 mg/L AgNPs giai đoạn tạo hoàn chỉnh cho tỷ lệ sống, số lá, chiều cao cây, diện tích lá, khối lượng tươi cây, hàm lượng Chlorophyll, khối lượng tươi củ, hàm lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1) củ đạt tối ưu so với nghiệm thức khác (Bảng 3.13 3.14, Biểu đồ 3.5, 3.6, Hình 3.13) 20 Bảng 3.13 Khả thích nghi sinh trưởng sâm Ngọc Linh vĩ xốp sau tháng nuôi trồng Nano (mg/L) AgNPs FeNPs 0,0 1,2 - 0,0 5,6 Tỷ lệ sống (%) 44,44c* 93,65a 63,49b Số 1,00c 3,33a 2,00b Chiều cao (cm) 1,16c 4,66a 3,30b Diện tích (cm2) 0,30b 3,70a 1,94b Khối lượng tươi (g) 1,03c 3,86a 2,10b Chlorophyll (nmol/cm2) 16,73b 23,95a 19,65b Ghi * Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan Bảng 3.14 Khả sinh trưởng phát triển sâm Ngọc Linh rỗ nhựa sau 12 tháng nuôi trồng Nano (mg/L) AgNPs 0,0 1,2 - FeNPs 0,0 5,6 Số Chiều cao (cm) 1,66b* 4,33a 2,33b 1,63c 6,73a 3,90b Diện tích (cm2) 0,52c 6,02a 2,68b Khối lượng tươi (g) 1,43c 5,20a 2,66b Chlorophyll (nmol/cm2) 19,73b 24,95a 20,98b Ghi * Những chữ khác (a,b,c ) cột thể khác biệt có ý nghĩa mức a = 0,05 phép thử Duncan Biểu đồ 3.5 Khối lượng tươi củ sâm Ngọc Linh sau năm trồng điều kiện nhà kính 21 Biểu đồ 3.6 Hàm lượng saponin củ sâm Ngọc Linh sau năm trồng điều kiện nhà kính Hình 3.8 Sự thích nghi, sinh trưởng phát triển salem sau tuần 12 tuần ni trồng Hình 3.9 Sự thích nghi, sinh trưởng phát triển dâu tây sau tuần 12 tuần ni trồng Hình 3.10 Sự thích nghi, sinh trưởng phát triển salem sau tháng 12 tháng ni trồng Hình Error! No text of specified style in document 11 Sự sinh trưởng, phát triển sâm Ngọc Linh sau 24 tháng ni trồng điều kiện nhà kính a: có nguồn gốc từ mơi trường khơng bổ sung AgNPs khơng thay Fe-EDTA FeNPs; b: có nguồn gốc từ môi trường 22 bổ sung 1,2 mg/L AgNPs; c: có nguồn gốc từ mơi trường thay Fe-NPs 5,6 mg/L FeNPs KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy tác động tích cực nano kim loại (AgNPs, FeNPs) lên trình khử trùng, sinh trưởng, phát triển nâng cao chất lượng giống salem, dâu tây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro 0,2 g/L AgNPs 20 phút 0,5 g/L AgNPs 15 phút mẫu salem; 0,2 AgNPs 20 phút mẫu dâu tây; 0,2 g/L AgNPs 20 phút mẫu sâm Ngọc Linh cho hiệu khử trùng bề mặt cảm ứng mẫu cấy cao 1,2 mg/L AgNPs cho hiệu hình thành huyền phù tế bào salem cao ngày nuôi cấy thứ 20 từ ngày 16 – 20 thời gian thích hợp cho việc cấy chuyền huyền phù tế bào 1,6 mg/L AgNPs cho hiệu tái sinh chồi salem đạt tối ưu sau tuần nuôi cấy 1,6 mg/L AgNPs cho hiệu tái sinh tăng sinh phôi sâm Ngọc Linh cao sau 14 tuần nuôi cấy 0,4 mg/L AgNPs salem; 0,5 mg/L AgNPs 1,4 mg/L FeNPs dâu tây; 1,2 mg/L AgNPs sâm Ngọc Linh có hiệu cao lên q trình tạo hồn chỉnh nuôi cấy in vitro 0,4 mg/L AgNPs salem; 0,5 mg/L AgNPs dâu tây; 1,2 mg/L AgNPs sâm Ngọc Linh cho hàm lượng AgNPs hấp thu tích hợp khí ethylene tích luỹ bình ni cấy thấp có ảnh hưởng tích lên sinh trưởng phát triển nuôi cấy in vitro 23 Cây salem, dâu tây sâm Ngọc Linh có nguồn gốc từ mơi trường ni cấy tương ứng có bổ sung 0,4 mg/L AgNPs, thay 1,4 mg/L FeNPs có bổ sung 1,2 mg/L AgNPs cho khả thích nghi, sinh trưởng phát triển tối ưu giai đoạn ex vitro Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu nano kim loại khác lên sinh trưởng, phát triển nâng cao chất lượng giống nhiều loại trồng nhằm tìm chất điều hồ sinh trưởng hay nguồn vật liệu để thay dinh dưỡng khống mơi trường ni cấy in vitro Phân tích hấp thu, vận chuyển, tích luỹ, chuyển hố nano kim loại q trình ni cấy in vitro tác động chúng lên kim loại khác hệ enzyme thực vật Triển khai ứng dụng nano kim loại vi nhân giống canh tác giống trồng quy mơ thương mại 24 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Đỗ Mạnh Cường, Lê Thành Long, Hoàng Thanh Tùng, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Nhật Linh, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt (2018), Vai trị nano bạc nâng cao tần xuất hình thành tế bào đơn hoa salem (Limonium sinuatum (L.) Mill), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 16(3), tr 481-490 Đỗ Mạnh Cường, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt (2018), Ảnh hưởng nano bạc lên khả cảm ứng mô sẹo tái sinh chồi từ mẫu dâu tây (Fragaria × ananassa) ni cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên, 127(1C), tr 61-70 Đỗ Mạnh Cường, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Đắc Khải, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt (2020), Nâng cao tần xuất phát sinh phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thông qua khử trùng mẫu nano bạc bổ sung nano bạc môi trường nuôi cấy, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 18(3), tr 517-527 Đỗ Mạnh Cường, Hà Thị Mỹ Ngân, Hoàng Thanh Tùng, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt (2020), Nghiên cứu ảnh hưởng nano sắt lên hình thành rễ tạo hồn chỉnh dâu tây (Fragaria × ananassa) sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Đại học Khoa học Huế, 17(2), tr 93-105 Do Manh Cuong, Phan Cong Du, Hoang Thanh Tung, Ha Thi My Ngan, Vu Quoc Luan, Truong Hoai Phong, Hoang Dac Khai, Truong Thi Bich Phuong, Duong Tan Nhut (2021), Silver nanoparticles as an effective stimulant in micropropagation of Panax vietnamensis–a valuable medicinal plant, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 146, pp 577-588 ... nhân giống lên chất lượng giống số loại trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây sâm Ngọc Linh) Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng bổ sung vào... lên chất lượng giống in vitro số trồng có giá trị kinh tế? ?? Trong nghiên cứu này, trồng sử dụng làm đối tượng nghiên cứu salem (Limonium sinuatum), dâu tây (Fragaria × ananassa) sâm Ngọc Linh (Panax... hồ sinh trưởng thay dinh dưỡng khống nhằm cải thiện nhược điểm hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng giống nuôi cấy mô, tiến hành thực đề tài ? ?Nghiên cứu tác động nano bạc nano sắt lên chất