Nghiên cứu khai thác flavonoid tổng số từ vỏ đậu xanh bằng phương pháp ngâm tĩnh có sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát sự ảnh hưởng của công suất siêu âm và thời gian xử lý siêu âm đến khả năng khai thác flavonoid từ vỏ đậu xanh. Qua đó tạo ra chế phẩm có hoạt tính sinh học ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Mời các bạn tham khảo!

Kỷ yếu hội thảo khoa học – Phân ban Công nghệ thực phẩm NGHIÊN CỨU KHAI THÁC FLAVONOID TỔNG SỐ TỪ VỎ ĐẬU XANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM TĨNH CÓ SỰ HỖ TRỢ CỦA SÓNG SIÊU ÂM Nguyễn Thị Thùy Trang1,*, Ngơ Thị Bích Quy1,*, Hồng Thị Trúc Quỳnh1 Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học công nghiệp thực phẩm Tp.HCM * Email: thuytrangnt0706@gmail.com, bichquy1504@gmail.com Ngày nhận bài: 15/06/2017; Chấp nhận đăng: 02/07/2017 TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng công suất siêu âm thời gian xử lý siêu âm đến khả khai thác flavonoid từ vỏ đậu xanh Qua tạo chế phẩm có hoạt tính sinh học ứng dụng cơng nghệ thực phẩm Nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp trích ly ngâm tĩnh kết hợp siêu âm với thông số: nhiệt độ trích ly 600C giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/30, thời gian siêu âm 15 phút, công suất 35% (262.5 W/g) Kết khảo sát cho thấy phương pháp trích ly ngâm tĩnh kết hợp siêu âm mang lại hiệu cao ngâm tĩnh truyền thống dung môi chiết Hiệu chiết nước tốt an tồn, mang tính kinh tế so với dung môi methanol, ethanol ethyl acetate Hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) cao mẫu dịch chiết phương pháp trích ly ngâm tĩnh kết hợp siêu âm đạt 8.983 ± 0.363 mgQE/g, cao gấp 1.481 lần so với phương pháp ngâm tĩnh 600C giờ, tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi 1/30 Từ khóa: vỏ đậu xanh, flavonoid tổng số, trích ly, siêu âm, kháng oxi hóa, quercetin MỞ ĐẦU Đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học Vigna radiata (L) Vỏ đậu xanh có chứa nhiều hoạt chất thuộc nhóm flavonoid Flavonoids nhóm sắc tố thực vật có vai trị lớn việc tạo màu sắc nhiều loại hoa Màu sắc có ý nghĩa quan trọng sản xuất sản phẩm thực phẩm đồ uống Thơng qua việc trích ly nguồn flavonoid từ tự nhiên, người sử dụng để thay loại màu tổng hợp (Albert Szent-Gyorgyi, 1936) Nhiều nghiên cứu gần cho thấy flavonoids hữu ích việc điều trị ngăn ngừa nhiều tình trạng bệnh lý thể, có tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào ung thư, chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức gan (Đỗ Tất Lợi, 1995) Việc tìm phương pháp khai thác flavonoid hiệu suất cao tạo chế phẩm mang hoạt tính sinh học việc làm cần thiết Đồng thời, việc đánh giá sơ khả kháng oxi hóa vỏ đậu xanh chế phẩm khai thác từ nguyên liệu 75 Nguyễn Thị Thùy Trang, Ngô Thị Bích Quy, Hồng Thị Trúc Quỳnh nàylà tiền đề cho việc nghiên cứu phát triển sản phẩm thương mại chứaflavonoid cơng nghệ thực phẩm Hiện nay, có nhiều phương pháp trích lyflavonoid từ nguyên liệu tự nhiên trích ly cách ngâm tĩnh, trích ly với hỗ trợ sóng siêu âm, vi sóng, trích ly với dung môi siêu tới hạn… (Keerthi Srinivas, Jeana Monrad, 2009) Trong nghiên cứu này, lựa chọn phương pháp trích ly ngâm tĩnh kết hợp hỗ trợ sóng siêu âm với mục đích nâng cao hiệu khai thác flavonoid từ nguyên liệu vỏ đậu xanh Để hiệu suất thu hồi đạt cao điều kiện xác định biện pháp tối ưu hóa chọn lựa nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Hóa chất: chất chuẩn Quercetin, AlCl3.6H2O, ethanol, NaNO2, NaOH 1M, methanol ethyl acetate Nguyên liệu: Vỏ hạt đậu xanh phế phẩm nông nghiệp thu gom từ sở nhà máy chế biến đậu xanh Nguyên liệu vỏ sàng để loại tạp chất, sấy vỏ đậu đạt độ ẩm < 8% bảo quản điều kiện kín Nguyên liệu nghiền mịn đến kích thước 0.5 - mm để tăng hiệu trích ly Tất mẫu bảo quản nhiệt độ phòng túi PE kín tránh hút ẩm để tiến hành thí nghiệm phân tích (Chew et al., 2011; Jin Dai et al., 2010) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, thời gian nhiệt độ đến hàm lượng TFC phương pháp ngâm tĩnh - Khảo sát ảnh hưởng loại dung mơi trích ly đến TFC: Cân xác 2g bột mẫu vào bình tam giác thêm 40 ml dung môi (ethanol, nước, methyl, ethyl acetate) Tiến hành trích ly bể ổn nhiệt 600C 60 phút Lọc lấy dịch trích ly, quay chân không nhiệt độ 400C dịch cạn hồn tồn, thêm nước cất định mức lên 25ml Tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng số theo phương pháp tạo màu với AlCl3 môi trường kiềm-trắc quang (Leonardo, 2011) Kết thí nghiệm sở để chọn loại dung môi phù hợp cho q trình trích ly để thực bước khảo sát - Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi trích ly đến TFC: Cân xác 2g bột mẫu vào bình tam giác thêm dung môi với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/10, 1/20, 1/30, 1/40 1/50 trích ly nhiệt độ 600C Tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng số theo phương pháp tạo màu với AlCl3 - Khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến TFC: Cân xác 2g bột mẫu vào bình tam giác thêm dung mơi, tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi, tiến hành trích ly nhiệt độ 600C mốc thời gian 30, 45, 60, 75 90 phút Tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng số theo phương pháp tạo màu với AlCl3 - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến TFC: Cân xác 2g bột mẫu vào bình tam giác thêm dung mơi theo tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, thời gian chọn thí nghiệm khảo sát mức nhiệt độ: 40; 50; 60; 70; 800C Tiến hành xác định hàm lượng flavonoid tổng số theo phương pháp tạo màu với AlCl3 76 Nghiên cứu khai thác flavonoid tổng số từ vỏ đậu xanh phương pháp ngâm tĩnh có hỗ trợ sóng siêu âm 2.2.2 Tối ưu hóa điều kiện trích ly ngâm tĩnh có hỗ trợ sóng siêu âm Hỗn hợp nước vỏ đậu xanh trích ly hỗ trợ siêu âm Tiến hành siêu âm mức công suất 25% (187.5 W/g), 30% (225 W/g), 35% (262.5 W/g), siêu âm 10, 15 20 phút mẫu đối chứng không qua xử lý siêu âm Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology – RSM) áp dụng để tối ưu hóa điều kiện q trình trích ly hỗ trợ siêu âm Số thí nghiệm tính theo cơng thức: N = 2k + 2k + n0 Trong k số yếu tố thí nghiệm, n0 số thí nghiệm tâm Các yếu tố khác (khối lượng mẫu, loại dung môi, thời gian ngâm tĩnh ) giữ cố định thí nghiệm khảo sát Xác định thơng số yếu tố ảnh hưởng thời gian siêu âm công suất cách sử dụng quy hoạch trực giao đối xứng, yếu tố tiến hành mức (-1, 0, +1) Phương trình hồi quy sử dụng để dự đoán phụ thuộc hàm lượng flavonoid vào yếu tố thí nghiệm đa thức bậc hai có dạng sau: Y = b0 + b1X1 + b2X2+ b12X1X2 + b11X12 + b22X2 Trong đó: b0, b1, b2, b12, b11, b22 hệ số phương trình hồi quy b0: hệ số hồi quy b1, b2: hệ số tuyến tính b11, b22: hệ số tương tác đối Mỗi hệ số b đặc trưng cho ảnh hưởng yếu tố đến q trình trích ly flavonoid Trong đó: Y: hàm lượng flavonoid tổng thu (mgQE/g CK) X1: công suất (W/g) X2: thời gian (phút) Sử dụng phần mềm JMP để thiết kế xử lý số liệu thực nghiệm 2.3 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 2.3.1 Phương pháp phân tích Hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) xác định thông qua phương pháp tạo màu với AlCl3 môi trường kiềm-trắc quang cách xây dựng đường chuẩn với quercetin, đo độ hấp thụ quang học bước sóng 510 nm [1] [2] Chuẩn bị dung dịch thử: lấy xác 1ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 10ml Thêm vào ml nước cất, sau thêm vào 0.3 ml dung dịch NaNO2 5% Sau phút thêm tiếp 0.3 ml dung dịch AlCl3 10%, sau phút cho vào ml dung dịch NaOH 1M lắc định mức đến thể tích 10 ml nước cất Để yên 20 phút, độ hấp thu dung dịch phản ứng đo bước sóng 510 nm Quercetin sử dụng làm chất chuẩn tham khảo kết quy tương đương theo số milligamquercetin/1 gam mẫu nguyên liệu [3] Hàm lượng flavonoid tổng số (mg) chiết g nguyên liệu tính theo cơng thức sau: Flavonoid tổng (mgQE/g) = (C.f.V.100)/(m.(100-h) Trong đó: C: nồng độ flavonoid tổng dịch chiết tính theo quercetin (µg/ml) 77 Nguyễn Thị Thùy Trang, Ngơ Thị Bích Quy, Hồng Thị Trúc Quỳnh V: thể tích dịch chiết (ml) m: khối lượng (g) f: hệ số pha loãng h: độ ẩm (%) - Xác định độ ẩm: cân phân tích độ ẩm - MB45 2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu Trong nghiên cứu này, thí nghiệm tiến hành lặp lại ba lần, kết trình bày dạng giá trị trung bình± giá trị sai số Kết tính tốn phần mềm Microft Office Excel 2010 phần mềm thống kê JMP Kết phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, so sánh khác biệt nghiệm thức qua phép thử LSD KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hàm lượng TFC (mgQE/g) 3.1 Ảnh hưởng loại dung mơi trích ly đến hàm lượng TFC 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 a b c d Nước Methanol Ethanol Loại dung mơi Ethyl acetat Flavonoid Hình Ảnh hưởng loại dung mơi trích ly đến hàm lượng flavonoid tổng (mgQE/g) Biểu đồ thể hàm lượng flavonoid tổng vỏ đậu xanh từ loại dung môi nước, ethanol, methanol ethyl acetate Trong dung môi khảo sát, dung môi nước cho hiệu cao Các kết có hồn tồn phù hợp độ phân cực dung môi dùng để chiết tách tính tan hợp chất flavonoid nguyên liệu Trong thực tế, việc sử dụng dung mơi nước có nhiều thuận lợi ethanol methanol an toàn kinh tế Kết cho thấy nước dung mơi trích ly hàm lượng flavonoid tổng số cao (4.196 mgQE/g) Các flavonoid dạng glycosid có tính chất dễ tan nước dung môi phân cực, dạng aglycon tan dung môi hữu cơ, khó tan nước Theo nghiên cứu Albert Szent - Gyorgyi flavonoid glucoside thường dễ tan dung môi phân cực [4] [5] Từ kết trên, nước dung môi lựa chọn để khảo sát tiếp 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi trích ly đến hàm lượng TFC Ảnh hưởng nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng flavonoid tổng thể biểu đồ 78 Nghiên cứu khai thác flavonoid tổng số từ vỏ đậu xanh phương pháp ngâm tĩnh có hỗ trợ sóng siêu âm 6.00 a TFC (mgQE/g) 5.00 b b a 4.00 3.00 c 2.00 1.00 0.00 1/10 1/20 Tỷ lệ NL / DM 1/30 1/40 1/50 Flavonoid Hình Ảnh hưởng tỷ lệ NL/DM trích ly đến hàm lượng flavonoid tổng (mgQE/g) Kết cho thấy, q trình trích ly tăng lượng dung mơi với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/10 lên đến tỷ lệ 1/30 hàm lượng flavonoid tổng tăng theo (Tỷ lệ 1/10 2.156 mgQE/g; 1/30 4.817 mgQE/g) Tuy nhiên, tăng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi lên 1/40 hàm lượng flavonoid tổng số lại giảm (4.372 mgQE/g) so với tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/30 Các kết phù hợp với nguyên tắc truyền khối mà động lực cho khối lượng chuyển khối coi gradient nồng độ chất rắn dung mơi Tỷ lệ dung mơi cao thúc đẩy gradient nồng độ tăng, dẫn đến tăng tốc độ khuếch tán cho phép q trình trích ly chất rắn dung môi tốt (Cacace Mazza, 2003; Al-Farsi Chang, 2007) Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid tổng không tiếp tục tăng đạt cân (Herodez et al., 2003) Dựa vào kết phân tích trên, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/30 lựa chọn cho bước nghiên cứu 3.3 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hàm lượng TFC Mặc dù hiệu trích ly thường tăng theo thời gian, việc kéo dài thời gian trích ly lại có điểm bất lợi mặt lượng 79 Nguyễn Thị Thùy Trang, Ngô Thị Bích Quy, Hồng Thị Trúc Quỳnh Hình Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hàm lượng flavonoid tổng (mgQE/g) Thời gian chiết ảnh hưởng đến tổng lượng flavonoid tổng chiết Trong đó, lượng flavonoid tổng số chiết cao sau 60 phút (7.713 mgQE/g), tiếp tục tăng thời gian trích ly lên 75 phút làm giảm lượng flavonoid tổng chiết xuống (7.135 mgQE/g) Kết cho thấy kéo dài thời gian chiết không làm tăng hàm lượng flavonoid tổng số dịch chiết mà giảm xuống tác động nhiệt độ thời gian dài làm phần flavonoid tổng số có dịch trích bị phá hủy [6] Kết giải thích định luật thứ hai Fick khuếch tán dự đoán trạng thái cân cuối nồng độ chất tan ma trận chất rắn dung mơi đạt sau thời gian định (Silva et al., 2007) Từ khảo sát trên, nhận thấy thời gian trích ly flavonoid tổng thích hợp 60 phút 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hàm lượng TFC Việc lựa chọn nhiệt độ trích ly thích hợp bước cuối chuỗi thí nghiệm Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiệu trích flavonoid tổng Sự thay đổi TFC theo nhiệt độ trích ly biểu diễn hình Hàm lượng TFC tăng đáng kể theo nhiệt độ tăng đạt đến đỉnh điểm tương ứng với nhiệt độ 600C, sau giảm xuống có ý nghĩa (p