Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis, lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus. Chúng tôi sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, xác định hoạt độ enzyme amylase, protease và khả năng tạo độ chua của

Phần 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việcsử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụngtrong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh Lý do đơn giản làcon người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh Nhữngchất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn.

Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng nhữngchất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá Việc sử dụngkháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sựkháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phátnặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trongthịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trongchăn nuôi.

Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trựctiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic” Kết quả đã chứng minhđược lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnhtrong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người Điều quan trọng là nó không để lạinhững hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh.

Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường

tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillusacidophilus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi

và thủy sản.

1.2 MỤC ĐÍCH

Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus

acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng

thủy sản.

1.3 YÊU CẦU

1.3.1 Đối với Bacillus subtilis

 Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau

để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease vàamylase nhiều nhất.

 Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis

 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.

1.3.2 Đối với Lactobacillus acidophilus

 Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất.

 Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất. Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.

 Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.

Phần 2 TỔNG QUAN

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

2.1.1 Lịch sử

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ

chức y học Nari của Đức Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho cácbinh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi

Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của

Bacillus subtilis Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các

chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa.

2.1.2 Phân loại và đặc điểm

2.1.2.1 Phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:Bộ: Eubacteriales

Họ: BacillaceaeGiống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis

2.1.2.2 Đặc điểm

Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn

nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G+), kíchthước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm Đứng thànhchuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử

nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm Phát triển bằngcách nảy chồi do sự nứt của bào tử Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích chosinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt khá cao Nồng độ muối ăn

làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000) Chúng

phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây).

Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine

nhanh chóng Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid

nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình

thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci

(Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không

đều hay phân tán Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ởgiữa sậm màu, rìa có răng cưa Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạothành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt.

Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa:

 Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol,saccharose, xylose, arabinose.

 Indol (-), VP (+), nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+),citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí.

2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC

Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loạinhư sau:

Họ: LactobacteriaceaeHọ phụ: Streptococcaceae

Giống: Streptococcus LeuconostocHọ phụ: Lactobacteriaceae

Giống: Lactobacterium

2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

2.2.1.1 Lịch sử

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của

trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loạicũng như chức năng của vi khuẩn này.

Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”.Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lạisự thối rữa ruột và sự lão hóa Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vikhuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột Do đó người ta nhanh chóng thay

thế chủng vi khuẩn này bằng chủng L acidophilus như là một probiotic trong ruột Họthấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trongruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lênmen đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus.

2.2.1.2 Đặc điểm

Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi

khuẩn lactic Chúng có dạng trực khuẩndài và chịu nhiệt Tế bào hình que, đầutròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µmđứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thànhchuỗi ngắn, không di động, không sinhbào tử, tế bào non bắt màu Gram dươngkhi nhuộm, tế bào già trở thành Gram

âm Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, không phát triển ở 20 - 22oC và 43 - 48oC.Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạngtròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏvà có hình dạng không ổn định Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, pháttriển kém và giới hạn theo vết cấy.

Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không pháttriển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môitrường dịch thể cao nấm men.

L acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất Là vi khuẩn

có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật Chúng có khả năng sinhBacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột.

L acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose,

mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol,mannitol, sorbitol, inositol Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate(-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+).

2.2.1.3 Quá trình trao đổi chất

Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào

nhóm lên men đồng hình bắt buộc Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theocon đường EMP Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lênmen gluconat và pentose Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acidlactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004).

Hình 2.2 Lactobacillus acidophilus

2.2.1.4 Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men

Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắccác loại đường, casein và các thành phần khác.

 Sự thay đổi đường sữa

Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa

lactose thành glucose và galactose Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốnđược chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn Lactose sẽ được chuyển hóa theo haicon đường:

Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H2

chuyển lactose thành glucose và galactose.

Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionatsau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biếnphức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách.

 Sự thay đổi protein sữa

Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăngquá trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện Do đó, casein bị vón lại làm tăngquá trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau.

Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa

2.2.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như côngnghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quảnthực phẩm.

2.2.2.1 Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic Có vị chua dễ chịu và có

đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịchquả, mứt Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài racòn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.

+CO2ADP ATP NAD+

NADH

ATP ADP

Glucose-6 phosphate

ATP ADP

Fructose-6 phosphat

1,3 diphosphoglyceratGlyceraldehyd-3 phosphat

Fructose-1,6 phosphat

Dihydroxyaceton phosphat

acid pyruvicAldehyd acetic citric +2H

acid malic

Acetyl- CoA

acid propionic

Chu trình acid citric

acid lactic+2H

2.2.2.2 Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnhquan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là

cơ hội gây bệnh cho cây trồng.

Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm nàylà cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường.

2.2.2.3 Trong y dược

Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trongphẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa…

2.2.2.4 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm

Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa

chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả Dùng sản xuất tương,đậu phụ hay lên men sữa chua.

2.3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật thì trong môi trường lên men phải có chứa đầyđủ các thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001).

Glucid: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi

chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra glucid còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ranăng lượng cho tế bào Glucid thường được sử dụng dưới dạng dịch chiết có đường, mậtrỉ, tinh bột (phải thủy phân thành đường trước khi lên men).

Phosphat vô cơ: Đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng và tổng hợp

acid nucleic Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphatamon và phosphat kali.

Nitơ: Tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và chất có đặc tính sinh học

khác của tế bào vi sinh vật Nitơ thường sử dụng trong lên men dưới dạng muối nitrat,các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật.

Các chất sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng: Vitamin và các nguyên tố vi lượng

là những chất cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật Chúng thường được sử dụngvới lượng nhỏ nhưng tác dụng rất lớn và đa dạng không thể thiếu được đối với hoạt độngsống bình thường của vi sinh vật.

2.3.1 Đối với Bacillus subtilis

2.3.1.1 Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao

Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cảnhững chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme Vì vậy khituyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập và lựa chọn hàng chục, hàng trămnhững giống vi sinh vật để có được những chủng có hoạt độ cao trong việc tạo thành nhữngenzyme cần thiết Người ta thấy rằng enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu và khảnăng chịu nhiệt cao hơn enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998).

Trong đất có rất nhiều bào tử và tế bào vi sinh vật trong số đó người ta nhận thấy rằng

vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp enzyme α-amylase và protease.

2.3.1.2 Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn.

Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những nguyên liệu rẻ tiền và dễkiếm Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trườngnhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận α-amylase có thể dùng tinh bột,maltose, saccarose, glucose và glycerin Ngoài ra người ta còn cho thêm các acid aminở dạng phức hợp hoặc riêng từng cơ chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầmmạch, các acid amin )

Nếu môi trường có CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được

tổng hợp gấp hai lần Trong một phân tử gam α-amylase của Bacillus subtilis có 4g

nguyên tử calci Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả năng tổnghợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease(Lương Đức Phẩm, 1998).

Trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặtcủa các nguyên tố khoáng trong các dạng muối magie, phospho, kali, và các ion mangan,kẽm, và các nguyên tố vi lượng khác Nồng độ thích hợp để tổng hợp α-amylase củaMnSO4 là 0,05% Thiếu muối α-amylase không được hình thành.

Hoạt độ α-amylase được nâng cao ở nồng độ KH2PO4 là 1% Ion Mg2+ có tác dụng ổnđịnh amylase ở nhiệt độ cao

Lưu huỳnh cũng có tác dụng đến sinh tổng hợp α-amylase Các nguồn lưu huỳnh làcác acid amin (methionin, sistein, sistin) và các muối sunfat (trừ sunfat đồng), trong đónguồn lưu huỳnh tốt nhất là methionin.

2.3.1.3 Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn

Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease thì cần phải có các chất cảm ứng,các nguồn nitơ hữu cơ (bột ngô, bột đậu tương, bột mì, cám mì, mầm mạch, dịch chiết nấm

men, pepton, protein ) Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng hợp protease có hoạt độ cao ở môi

trường có tinh bột, nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 – 2% thì hoạt độ protease giảm vài lần.Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ thì nguồn nitơ vô cơ cũng ảnh hưởng đến khả năng tổnghợp protease như HNO3, HNO2 Trong số các nguồn nitơ vô cơ ta chỉ thấy có phosphatamon dibazic là tốt hơn cả Những muối khác như NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3,KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt độ protease tới 30 – 50% còn α-amylase giảm tới 7 – 10lần Trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì hoạt độ protease và amylase cũngthấp hơn trong môi trường đối chứng có (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương (LươngĐức Phẩm, 1998).

Các acid amin ức chế đến tổng hợp enzyme protease ở Bacillus subtilis là methionin,

acid glutamic, alanin, leucin

2.3.1.4 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật pháttriển trên bề mặt môi trường Môi trường sử dụng là môi trường lỏng hoặc sử dụng môitrường đặc (môi trường bán rắn).

Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩnngăn cách pha lỏng và pha khí Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môitrường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Ở môi trường đặc để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môitrường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật sẽphát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổnghợp ra enzyme nội bào và ngoại bào Độ ẩm thích hợp ở môi trường đặc là 55 – 65%.

Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạthường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý Nhưng nhược điểm là tốnnhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa.

Phương pháp nuôi cấy chìm

Phương pháp này người ta sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong nhữngthùng lên men Trong các thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống

cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng Trong đó hệ thốngđiều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi trườnglàm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinhvật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển,làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật Ưu điểm của phương pháp này là ít tốndiện tích và dễ cơ giới hóa nhưng có nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát.

2.3.2 Đối với Lactobacillus acidophilus

2.3.2.1 Nhu cầu sinh trưởng

Lactobacillus acidophilus là loài vi hiếu khí nên có thể phát triển trong điều kiện hiếu

khí và trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không lắc, ở điều kiện kị khí thì sự phát triển thíchhợp hơn Chúng phát triển mạnh trong môi trường agar ở điều kiện khí chuẩn (5% CO2,10% H2 và 85% N2)

2.3.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng

Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus acidophilus phản ánh bản chất rất khó của

những vi khuẩn này Môi trường nuôi cấy chuẩn thường rất giàu acid amin và vitamin nhưpepton, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol,monooleat (Tween 80), sodium acetat và muối magie kích thích sự tăng trưởng Môitrường nuôi cấy thường sử dụng là MRS lỏng (De Man, Rogosa và Sharpe)

2.3.2.3 Môi trường sản xuất

Trong sản xuất sinh khối người ta thường sử dụng sữa bò hay từ sữa đậu nành Dotrong sữa bò và sữa đậu nành có nhiều casein và nhiều thành phần dinh dưỡng khác nhau:

Thành phần của sữa bò

Trong sữa bò gồm có thành phần chính là protein bao gồm casein, lactoalbumin,lactoglobulin Casein là loại protein phức tạp (phosphoprotein) Trong sữa ngưng kếtcasein ở dạng phức chất caseinat-calci-phosphat.

Trong sữa tươi, casein ở dạng hòa tan là caseinogen, nếu sữa acid (pH = 4,5 - 4,7)thì casein lắng xuống, sữa ngưng kết thành khối Khi bị tác dụng của pepsin haychymozin thì casein chuyển thành dạng không hòa tan.

Trong sữa còn có triglyceric, acid béo bay hơi và acid béo không bay hơi chủyếu là acid oleic (40,6%), acid palmitic và stearic (50,9%), các glyceric khác chiếm8,5% Ngoài ra còn có vết lecithin, cholesterol (Trần Thị Dân, 2000).

Thành phần hóa học của sữa đậu nành

Trong đậu nành có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng nhưng người ta quan tâm nhiềunhất là hàm lượng protein và lipid, nhóm glucid của đậu nành không thuộc loại có giátrị cao về dinh dưỡng.

Protein đậu nành chiếm trên 40%, nó gấp 10 lần so với sữa, gấp 2 lần so với thịtbò Ngoài ra protein đậu nành còn có chứa đủ các acid amin thiết yếu như lysine,methionin, isoleucin, tryptophan

Lipid đậu nành chiếm 20%, chủ yếu chứa hai thành phần quý là trylycerid vàlecithin, hàm lượng acid béo không no cao (khoảng 85%), acid béo no thấp (15%).

Trong đậu nành còn chứa các vitamin A, E, K, B1, B2 chiếm khoảng dưới 1% vàcác khoáng chất chiếm khoảng 5% nhưng chất lượng dinh dưỡng của các khoáng chấttừ đậu nành thấp hơn so với các khoáng chất của động vật.

Ngoài ra trong đậu nành còn chứa một số chất không có lợi khác như chất ứcchế trypsin, chất này làm giảm sự sinh trưởng gây phình to tụy tạng động vật Những chất như hemaglutinins gây đông tế bào máu, cản trở sự hoạt động củahồng cầu Chất goitrogens gây phình to tuyến giáp, urease gây phân giải proteinthành amoniac gây độc cho cơ thể Các chất độc này đa số tập trung ở màng ngoàicủa hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2004).

2.3.2.4 Điều kiện sản xuất

Trước khi lên men, sữa phải được thanh trùng để loại bỏ những vi sinh vật tạp nhiễmcó trong sữa Người ta thường sử dụng phương pháp Pasteur để thanh trùng sữa (65oCtrong 30 phút hoặc 72 – 75oC trong 10 - 20 giây) Sau khi thanh trùng người ta cấy vikhuẩn lactic vào sữa, lượng giống cho vào từ 5 - 10% Sau một thời gian lên men thì sữacó độ chua khá cao thường là 90 – 120oT (oT = độ chua Therne) và đông vón lại.

2.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC (Trích dẫn của Lã Văn Kính, 1998).2.4.1 Định nghĩa probiotic

Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tảnhững yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật Probiotic được bắtnguồn từ gốc Hylạp với nghĩa “tiền sự sống” (prolife).

Năm 1989 Fuller định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vi sinh vật sốngcó tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó.

Năm 1992 Havenar et al chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ởnhững thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột Ông nới rộng định nghĩaprobiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hay hỗn hợp của các vi sinh vật sống màchúng (dùng áp dụng cho người và động vật) có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằngcách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ.

2.4.2 Cơ chế tác động

2.4.2.1 Duy trì hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột

Động vật khỏe mạnh có hệ thống tiêu hóa hoạt động tốt Đó là cơ sở cho sự chuyểnhóa có hiệu quả thức ăn cho duy trì và sản xuất Đặc tính quan trọng nhất của đườngtiêu hóa hoạt động tốt là sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong nó Vi khuẩn lactic cómặt khắp đường ruột và trong một số điều kiện nó là vi khuẩn chiếm ưu thế (Fuller,1977; Jin et al,1997) Sự cân bằng trong đường ruột bị phá vỡ khi các động vật bịstress như nhiệt độ cao, độ ẩm cao, thay đổi thức ăn, vận chuyển…Việc cho con vật ănthường xuyên probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật bằng hai con đường: Chống lại visinh vật gây bệnh và bằng hoạt động đối kháng.

2.4.2.2 Hoạt động đối kháng

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức chế sự

phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm Chateau et al (1993) phân lập được

103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại vàkiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella Khoảng 47% Lactobacillus của sảnphẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E coli.

Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L acidophilus, L.

casei và L faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella.

Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sựphát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E coli

Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd.

Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành phần protein sinh họcchủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976).

Các chủng Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm

khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al.,1995) Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác.

Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,

Salmonelle spp, E coli và Staphylococcus spp Vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất

rộng Vincent et al (1959) kết luận rằng L acidophilus có thể đóng vai trò quan trọng trong

việc kiểm soát các vi sinh vật có hại trong đường ruột của gia súc và người.

Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối củaquá trình trao đổi chất Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do

Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm) Các sản

phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acetic (Trammer,1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952) Dahiafa và Speck,1968); Price và Lee, 1970) Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinhvật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972): Adams và Hall (1988)phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH Nếu độ pH thấp sẽtăng mức độ acid ở dạng không hòa tan.

2.4.2.3 Sự loại trừ cạnh tranh

Fuller (1977) báo cáo rằng các chủng Lactobacillus 59 và 74/1 có khả năng giảm

E coli trong diều và ruột non nhưng không làm giảm trong ruột già của gà.

Muralidhara (1977) tìm ra rằng tính đồng nhất của các mô bào ruột non được cung

cấp Lactobacillus lactic đã có nhiều Lactobacilli hơn và ít E coli hơn các động vật

bình thường hoặc tiêu chảy.

Francis (1978) kết luận rằng việc thêm các chế phẩm Lactobacillus ở mức 75 mg/kgthức ăn đã giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng Coliform trong ruột non và ruột thừa ở gà tây.

Watkin (1982) và Miller (1983) đã thấy sự giảm đáng kể E coli trong đường dạdày ruột của gà đã được cho ăn, uống Lactobacillus acidophilus

Tuy nhiên có nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sửdụng probiotic Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng các vi sinh vậtcần phải sống sót và phát triển trong đường ruột phải có khả năng sống trong môi trườngpH thấp và có khả năng chống lại tác dụng của mật Để sống được trong đường ruột, cácchủng vi sinh vật cần có khả năng đính vào và sinh sôi nảy nở ở trên bề mặt của ruộtnon Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật có lợitrong đường ruột có thể ức chế sự thâm nhập của vi sinh vật có hại (Rolfe, 1991) nhưngcơ chế chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng probiotic vẫnchưa được khẳng định Trong số các cơ chế này có sự cạnh tranh về vị trí, cạnh tranhchất dinh dưỡng, cạnh tranh về khối lượng các chất sinh ra bởi vi sinh vật.

2.4.2.4 Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa

Hệ vi khuẩn đường ruột của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêuhóa và hấp thụ thức ăn ăn vào của vật chủ Chúng tham gia vào sự trao đổi chất củacác chất dinh dưỡng như là carbon hydrat, protein, lipid và khoáng Các chất này cũngcó vai trò trong sự tổng hợp các vitamin Nahashon et al (1992, 1993, 1994, 1996) phát

hiện rằng bổ sung lứa cấy Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp/ lúa mạch/ đậu nành

đã kích thích tính thèm ăn và làm tăng tích lũy mỡ, nitơ, phospho, đồng và mangancho gà đẻ.

2.4.2.5 Sự trao đổi chất của vi khuẩn. Hoạt tính enzyme tiêu hóa.

Lactobacillus spp và Bacillus spp có khả năng sản xuất enzyme tiêu hóa trong điều

kiện thí nghiệm và trong ruột Chúng làm tăng khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡngđặc biệt trong ruột dưới (March, 1979; Sison, 1989).

Những enzyme chúng tiết ra gồm: amylase, protease, và lipase…(Jin et al,1996).Những enzyme này có hoạt tính phân giải tinh bột, lipid và protein (Moon và Kim,1989; Lee, 1990).

 Ngăn chặn sản sinh amoniac

Ngăn chặn sự sản sinh amoniac và hoạt động của urease có thể là có lợi để cảithiện sức khỏe gia súc và làm tăng cường sinh trưởng của gia súc bởi vì amoniac đượcsản sinh do sự phân giải urê trong màng nhày ruột non có thể gây nên một sự thiệt hạiđáng kể đến bề mặt của tế bào.

Chiang và Hsieh (1995) báo cáo rằng probiotic (chứa L acidophilus, S faecium và B.

subtilis) làm giảm nồng độ amoniac trong phân và chất độn chuồng của gà Broiler.

2.4.3 Vai trò của probiotic

Probiotic tác dụng rất có lợi đối với cơ thể con người và động vật như: Trung hòa độc tố ruột.

 Kích thích hệ thống miễn dịch, đặc biệt quan trọng trong sự phát triển khả năngmiễn dịch ở gia súc non chống lại những kháng nguyên có thể gây ra nhữngphản ứng viêm (Perdigon et al,1990).

 Khả năng gắn vào tế bào ruột nhằm loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhângây hại.

 Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.

 Tạo ra các acid, H2O2 và các Bacterion chống lại sự phát triển của các tác nhângây bệnh.

 An toàn, không lan truyền rộng, không gây ung thư và không gây bệnh (Lê ThịHồng Tuyết, 2004).

 Giúp ích cho tiêu hóa thức ăn đặc biệt một số loại vi khuẩn có khả năng tổng hợpvitamin nhóm B, vitamin K… Có thể làm giảm cholestrol trong máu nếu sử dụngliều cao và thường xuyên Giúp cải thiện được tình trạng không sử dụng đượcđường lactose Gần đây nhất có nghiên cứu cho thấy người mẹ mang thai dùng

thuốc có chứa Lactobacillus, sau khi sinh tiếp tục dùng trong thời gian cho con bú

có thể giúp trẻ ngừa được một số bệnh dị ứng như eczema (Nguyễn Hữu Đức,Thuốc và sức khỏe số 202, 2001).

2.4.4 Một số chế phẩm probiotic có chứa B subtilis và L.acidophilus hiện nay

Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khácnhau Những chế phẩm này được dùng trong chăn nuôi và thủy sản như:

 Enzymbiosub của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng để phòng và trịcác bệnh tiêu chảy cấp, mãn tính, rối loạn đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm vàcá, giúp tăng cường tiêu hóa, kích thích tăng trưởng.

 Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùngkích thích tôm, cá sử dụng triệt để nguồn thức ăn, giúp tôm, cá tiêu hóa tốt thứcăn và tăng trọng nhanh Cải thiện môi trường nước, kích thích tảo có lợi, phiêusinh vật phù du có trong ao nuôi, tạo nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào cho tôm,cá Ổn định hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột, lấn át, tiêu diệt các vi khuẩncó hại Phòng và điều trị có hiệu quả các bệnh đường tiêu hóa, bệnh phân trắng,bệnh nhiễm trùng đường ruột cho tôm, cá…

 Baciflora For Shrimp của công ty liên doanh Bio – Pharmachemie có tác dụngtượng tự như các chế phẩm trên.

 Vime-bactevit, của công ty Vemedim Vietnam được dùng cho cá, tôm cũng có

tác dụng tương tự.

 Lactogen của công ty Gấu Vàng được dùng cho heo gà cũng có tác dụng tương tự.

 Ngoài các chế phẩm trong nước còn có rất nhiều loại chế phẩm của nước ngoài đượcdùng trong chăn nuôi và thủy sản như: Protexin, Unleash, hay Florazyme efa …

2.4.5 Một số đề tài đã nghiên cứu

2.4.5.1 Trong nước

 Theo Nguyễn Văn Đông (1993) đã khảo sát một số tính chất của vi khuẩn

Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl để phòng và trị bệnh tiêu

chảy cho heo con Ghi nhận vi khuẩn Bacillus subtilis không có độc lực khi

truyền qua đường tiêu hóa, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh:

Staphylococcus aureus, E.coli.

 Năm 2001, Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chí Quốc đã nghiên cứu

một số đặc tính trợ sinh học (probiotic) của Bacillus subtilis trong phòng bệnhđường tiêu hóa của gà và ghi nhận rằng Bacillus subtilis có khả năng ức chế sựsinh trưởng và phát triển của E coli invitro Gà được ăn chế phẩm Bacillus

subtilis ở lượng 106 cfu/g có thể ổn định hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đặc biệt

là E coli, và có thể tồn tại trong chế phẩm với thời gian bảo quản là 6 tháng.

 Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Vitom3

(Bacillus subtilis chủng VKPMV – 7092) để phòng trị bệnh phân trắng cho heo

con ghi nhận rằng Vitom3 có tác dụng kích thích tăng trọng, phòng bệnh heocon phân trắng, tỷ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh 100% và không cóheo bị tái phát.

 Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải và Võ Thị Hạnh (2004) đã nghiên cứu sản xuất và sửdụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩuphần ăn của bò vắt sữa và bê sau cai sữa đã kết luận rằng bê được bổ sung 50 gamBIO-C tăng trọng cao hơn từ 48 – 49 g/ con/ ngày so với bê không bổ sung.

 Nguyễn Thị Lam Kiều, 2004 “Khảo sát đặc điểm sinh học của hai chủng Lactobacillus

trong men tiêu hóa” ghi nhận chúng có khả năng chịu được mật từ 0,2 – 0,6%, ức chế

E coli và có khả năng sinh acid và tiêu thụ đường.

 Tăng Thị Rít, Nguyễn Thị Bích Thủy, Quan Quốc Đăng và Nguyễn Kim Trinh,

2004 đã tổng hợp chế phẩm sinh học SH bổ sung vào thức ăn tôm sú Penaeus

monodon nhằm kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng bệnh đốm trắng.

Kết quả tỷ lệ pha trộn 1% chế phẩm vào thức ăn của tôm giúp tăng trọng hơn10% và tỷ lệ tôm sống sót trên 80% sau 30 ngày gây nhiễm nhân tạo bệnh đốmtrắng so với khoản 20% của lô không có bổ sung chế phẩm.

2.4.5.2 Ngoài nước

 Nhóm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm

Bioplus 2B (chứa Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) lên trình trạng sức

khỏe, tính năng sinh đẻ của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt Kết quả ghinhận được khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chếsự giảm trọng lượng của heo mẹ trong thời kỳ tiết sữa (15,3  3,6 đối với chếphẩm Bioplus 2B so với đối chứng là 18,8  3,1 Làm cải thiện các thông số củamáu và sữa (ngoại trừ lactose và chất rắn).

Ngoài ra nhóm nghiên cứu còn kết luận chế phẩm Bioplus 2B có ảnh hưởngđến tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩmchất quầy thịt ở heo đang lớn.

 Nhóm nghiên cứu của Sirirat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của probiotic

trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dòng S11 khônghạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu trùng

tôm (trọng lượng là 43,8 mg so với 26 mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là 1,83 0,31 so với đối chứng là 1,71  0,2 Tôm có tỷ lệ sống sót cao (13% so với 4%

đối chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng).Ngoài ra nhóm còn kết luận Bacillus dòng S11 không có ảnh hưởng đến chấtlượng nước ao nuôi và Arterma là vật mang probiotic có hiệu quả.

2.5 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME

Enzyme hay còn gọi là “men” là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Chúngcó trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặchiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá

trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà nó còn xúc tác cho cácphản ứng ngoài tế bào “invitro” Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme còn được gọi

là chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.

2.5.1 Enzyme amylase

Hình 2.3 Enzyme α-amylase

Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhấttrong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống.

Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811 1814 Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, tronghạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Cho mãi tới thời gian gần đây người tamới thu nhận amylase từ malt Hiện nay người ta thu amylase từ canh trường vi sinh vậtchủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men (Nguyễn Quyết, 2004).

-2.5.1.1 Đặc điểm enzyme α-amylase

Enzyme amylase có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật Hiện nayngười ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, còn ởcác loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn.

Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase 1,4 glucan-4-glucanhydrolase), ß-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase

(α-(glucoamylase) Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase.

α-amylase thủy phân liên kết α -1,4 glucoside ở giữa mạch polysaccharide chính vìthế nhiều tài liệu còn gọi chúng là endoamylase.

Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớtbị giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác Khi có mặtion calci cấu trúc của α-amylase sẽ bền hơn, và kém bền trong môi trường acid.

Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này baogồm: dextrin (trong đó chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose.

α-amylase từ nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, song chúng đều cókhá nhiều tyrosin và tryptophan còn methionin rất ít và chỉ có khoảng 7 - 10 gốc cystein

α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfit và disunithidin Hoạt độ

của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion calci trong phân tử vì ion này đượcdùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việcổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gâybiến tính và tác dụng phân hủy protease.

Phản ứng thủy phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn:

 Giai đoạn đầu: Chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồtinh bột giảm nhanh, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa.

 Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành Nhờ đótinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phântử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếuthành dextrin phân tử thấp không cho màu với iốt và một ít maltose.

Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của

chế phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2 Còn

số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6 – 7, bị vô hoạthoàn toàn ở pH = 1 và bị vô hoạt một phần ở pH = 8.

2.5.1.2 Ứng dụng của α-amylase

Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinhhọc hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm,dược phẩm, lên men, công nghiệp dệt, sản xuất giấy và trong nông nghiệp.

 Trong công nghiệp rượu – bia

Vài chục năm trở lại đây chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Asp.

awamori,…) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) được thay thế

malt (đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từnguyên liệu có tinh bột.

 Trong sản xuất bánh mì

Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượngcủa bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp của bánh mì.

 Trong công nghiệp dệt

Chế phẩm amylase được dùng để rủ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Trongvải mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác Để làm vải mềm, có khảnăng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột và người ta thường sử

dụng enzyme amylase từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentricus) hay từ nấm

mốc Khi rủ hồ vải thì lượng chế phẩm tính cho dung dịch là 0,3 – 0,6g Nhiệt độ xử lýlà 90oC, thời gian từ 5 – 15 phút.

 Trong sản xuất thức ăn gia súc

Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay B subtilis

thêm vào thức ăn giàu tinh bột của động vật nhất là động vật còn non làm tăng khảnăng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng nhanh.

 Trong nghiên cứu sinh học

Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng củaamylase Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharidephân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao.

2.5.2 Enzyme protease

2.5.2.1 Nguồn thu nhận enzyme protease

Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ởtrong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Các loài vi sinh vật có khả năng tổng

hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn, Str griseus, Str rimosus…và một số loài nấm mốc Asp oryzae, Asp niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).

2.5.2.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vậtcũng có thể khác nhau về tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau:

 Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid

Một số tác giả khác chia protease ra ba nhómdựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:

 Protease acid: pH < 3 được ứngdụng trong sản xuất bia và côngnghiệp bánh kẹo.

 Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH

hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus

 Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạtđộng của chúng có serine.

Hình 2.4 Enzyme protease

Trong bốn nhóm kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giảiliên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid Ngược lại cácprotease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối vớicác dẫn xuất của aminoacid.

Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 - 27.000 dalton, trọnglượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin vào khoảng 33.800- 48.400 dalton Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vàokhoảng 30.000 – 40.000 dalton.

Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưngcho từng nhóm còn có một số gốc aminoacid khác Ví dụ histidin thường tham giatrong trung tâm hoạt động của các proteae-xerin, protease tiol còn tyrosin là trung tâmhoạt động của các protease kim loại Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease visinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liênkết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

E + S E – S E – S’ + P1 E + P2 Trong đó:

E – là enzyme, S – là cơ chất.

E - S – là phức chất enzyme – cơ chất

E - S’ – là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hóa (axilenzyme).

P1 – là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do mới được tạo thành)P2 – là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành).

2.5.3 Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Hiện nay người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạtđộ hoạt động của enzyme Ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xácđịnh gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm

cơ chất sau một thời gian phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

2.5.3.1 Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

Hiện nay người ta sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năngxúc tác của enzyme:

 Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau mộtthời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước

 Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất địnhcủa lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu

được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm.2.5.3.2 Đơn vị hoạt độ

Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động củaenzyme Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ Ngườita biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị:

 Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI) Đơn vị Katal (Kat)

 Đơn vị hoạt độ riêng

 Đơn vị hoạt độ riêng phân tử

 Ngoài ra còn có nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vịWohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU

Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục.

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN

Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phòng thí nghiệm ViSinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh.

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU3.2.1 Giống vi khuẩn

Chế phẩm chúng tôi sản xuất sử dụng hai loại vi khuẩn:

trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh.

 Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fushin, lugol…

 Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H2O2 30%, dầu soi kính, cồn  Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung

dịch casein 0,1%

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

3.2.4.1 Đối với Bacillus subtilis

 Môi trường tăng sinh nutrien broth (NB)

 Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrien agar (NA)

 Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin,môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môitrường Nomura.

 Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì…

Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.

3.2.4.2 Đối với Lactobacillus acidophilus

 Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB Môi trường phân lập MRSA

 Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa

 Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành.Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục.

3.3 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.3.1 Đối với Bacillus subtilis

3.3.1.1 Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi

trường nhân giống cấp 1Cách tiến hành:

Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7

trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37oC Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vàotừng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton-gelatin với các điều kiện khảo sát:

 Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Lượng giống: 5%

Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:

o Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục3.1 phần phụ lục)

o Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục3.2 phần phụ lục)

Môi trường

Số lượng tế bào vi

khuẩn enzyme amylaseHoạt độ enzyme proteaseHoạt độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3Edward

Fragie

NomuraPepton -gelatinRỉ đường + tinh bột 2%