Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 1 Đối với Bacillus subtilis
3.3.1. Đối với Bacillus subtilis
3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1
Cách tiến hành:
Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton-gelatin với các điều kiện khảo sát:
• Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
• Lượng giống: 5%
• pH = 7
• Thời gian nuôi cấy là 48 giờ
• Nhu cầu oxi: sử dụng máy lắc
Sau 48 giờ nuôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase và protease.
Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp trên lame (được trình bày ở mục 3.6 phần phụ lục)
Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:
o Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục 3.1 phần phụ lục)
o Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục 3.2 phần phụ lục)
Sau khi kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.
Môi trường
Số lượng tế bào vi
khuẩn enzyme amylaseHoạt độ enzyme proteaseHoạt độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 Edward Fragie Nomura Pepton - gelatin Rỉ đường + tinh bột 2%
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis Giống gốc Bacillus subtilis Môi trường NB (nutrien broth) Tăng sinh Môi trường Nomura s Môi trường Fragie su
Môi trường rỉ đường +2 % tinh bột s s Môi trường Edwards Môi trường pepton - gelatin 5 % giống 48 giờ, to phòng Kiểm tra Hoạt tính enzyme amylase Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Hoạt tính enzyme protease Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
Bảo quản, kiểm tra Chọn môi trường tối ưu nhất
Môi trường
A Môi trường B Môi trường C Môi trườngD
10 % giống
Chọn môi trường tối ưu nhất
Môi trường E
3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2
Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau:
Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E có bổ sung CaCO3 2% để ổn định pH môi trường. Tất cả các loại môi trường trước khi đem nuôi cấy đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút. Các thành phần môi trường này được trình bày chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục.
Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độ ẩm 60 – 65%, pH = 7. Từng loại môi trường được đặt trong các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 × 0,25 × 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg môi trường. Trong quá trình nuôi phải giữ ẩm cho môi trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian 72 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease.
Sau khi kiểm tra trên tất cả các môi trường A, B, C, D và E chúng tôi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất. Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần.
Môi trường
Số lượng tế bào vi
khuẩn enzyme amylaseHoạt độ enzyme proteaseHoạt độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 A B C D E
Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện tương tự như thí nghiệm 3.3.1.2. Sau thời gian nuôi 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem đóng gói, kiểm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất được thực hiện theo sơ đồ 3.2.
Nước 60 – 65 %
so với nguyên liệu giống cấp 2 tối ưuMôi trường nhân Khoáng hỗn hợp
Hấp khử trùng 1210C trong 20 - 25 phút
Đổ lên khay
Làm nguội đến 37oC
Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng
Giống Bacillus subtilis 10%
Sấy khô 40 - 45oC Đánh tơi
Xay mịn
Đóng gói, kiểm tra và bảo quản
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis
Chế phẩm chứa Bacillus subtilis
3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme
Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme amylase, protease và sau thời gian bảo quản 10, 20, 30 ngày ở nhiệt độ phòng. Phương pháp kiểm tra tương tự như thí nghiệm 3.3.1.1.