4. BầN LUẬN
4.1. Các mô hình nghiên cứu tác dụng của thuốc
4.1.1. Mô hình thử trên in-vitro
4.1.1.1. Nghiên cứu tác dụng kháng acid
Từ lâu, người ta đã biết HCl là yếu tố tấn công chắnh gây loét dạ dày tá tràng. Một trong các mục tiêu điều trị đặt ra là phải nâng pH dạ dày lên. Mô hình nghiên cứu tác dụng kháng acid thường được dùng để sơ bộ đánh giá tác dụng điều trị loét dạ dày tá tràng của thuốc theo cơ chế trung hoà acid, nâng pH dịch vị dạ dày. Qua đó, ta có thể đánh giá thuốc đang nghiên cứu là kháng acid mạnh hay yếu. Thuốc đối chiếu sử dụng trong mô hình này thường là các antacid đã rõ hiệu lực như muối hoặc base của magnesi, nhôm. Đây là một mô hình có phương pháp, kỹ thuật đơn giản, phù hợp với điều kiện của Việt Nam nên hay được sử dụng thử nghiệm trong nghiên cứu.
4.1.1.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt động pepsin
Mô hình thử tác dụng ức chế hoạt động pepsin thường tiến hành cùng với mô hình kháng acid. Thông thường thuốc có tác dụng antacid thì sẽ ức chế hoật động pepsin (vì pepsin chỉ hoạt động ở pH acid). Tuy nhiên, mô hình này dung fđể đánh giá thuốc nghiên cứu có tác dụng ức chế vào trung tâm hoạt động của enzym này hay không. Đây là mô hình thử trên in-vitro có kỹ thuật đơn giản nên hay được áp dụng ở Việt Nam. Hiện nay, theo một số tác giả cho rằng để kết quả nghiên cứu được chắnh xác hơn nên đánh giá khả năng ức chế hoạt động của pepsin trong dạ dày động vật.
4.1.1.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế bơm proton
Điếu hoà tiết HCl do histamin, acetylchilin, gastrin là thông qua bơm proton. Do đó, bơm proton có vai trò quan trọng trong bài tiết acid vào dạ dày. Khi ức chế bơm proton, acid bị ức chế tiết theo mọi nguyên nhân gây kắch thắch. Để nghiên cứu thuốc có khả năng ức chế bơm proton hay không thì phải đánh giá khả năng thuốc gắn vào receptor này. Phương pháp đã đánh giá trực tiếp khả năng ức chế bơm proton trên protein màng là thông qua định lượng sản phẩm trung gian Pị được giải phóng từ ATP. Qua đó có thể nghiên cứu cơ chế phân tử của thuốc mới sau khi đã thử tác dụng của thuốc trên in- vivo. Thuốc đối chiếu để so sánh trong mô hình này là nhóm thuốc ức chế bơm proton gồm omeprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol. Nếu thuốc nghiên cứu có tác dụng tương đương thuốc đối chiếu thì có thể cho rằng thuốc có tác dụng ức chế bơm proton. Trên thử nghiệm nghiên cứu này phải sử dụng các thiết bị, kĩ thuật hiện đại để phát hiện khả năng gắn receptor
ATPase. Vì vậy, hiện ồ Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào cơ chế phân tử có thể áp dụng trên thử nghiệm này.
4.1.1.4. Nghiên cứu tác dụng kháng cholinegic
Cũng tưoỉng tự như mồ hình thử tác dụng ức chế bơm proton, mô hình này dùng chất phóng xạ để phát hiện chất gắn vào receptor đặc hiệu hay không đặc hiệu. Từ đó có thể nhận định thuốc tác dụng theo cơ chế kháng cholinergic hay không. Yêu cầu về phương tiện, kĩ thuật trong mô hình này khá cao nên trong điều kiện của Việt Nam hiện chưa áp dụng để đi sâu vào cơ chế phân tử.
4.1.1.5. Nghiên cứu tác dụng ức chế Helicobacter pylori trên in- vitro
Helicobacter pylori có khả năng gây loét dạ dày tá tràng, do đó nghiên cứu thuốc diệt Hp là cần thiết. Để khảo sát khả năng thuốc ức chế trên vi khuẩn H.p, phương pháp đơn giản nhất là thử trên in-vitro- bằng cách đo vòng vô khuẩn trên môi trường thạch rồi so sánh với kháng sinh chuẩn. Mô hình sơ
bộ đánh giá thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn H.p hay không từ đó có thể định hướng thử trên in-vivo. Đây cũng là phương pháp hay được áp dụng ở Việt Nam để khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn của thuốc.
4.1.2. Mô hình thử trên in-vivo
4.I.2.I. Gây loét bằng phương pháp vật lý * Mô hình thắt môn vị
Mô hình Shay (thắt môn vị) thường là lựa chọn đầu tiên để khảo sát tác dụng chống loét dạ dày tá tràng của thuốc. Từ đó có thể kết luận sơ bộ thuốc có tác dụng chống loét dạ dày hay không. Tỷ lệ gây loét trên mô hình này là 40- 100% trong thời gian 18- 24 giờ sau khi thắt môn vị. Trong điều kiện của Việt Nam, mô hình này tiến hành đơn giản và cho kết quả tin cậy nên hay được áp dụng. Ngoài ý nghĩa khảo sát tác dụng chống loét dạ dày tá tràng của thuốc, mô hình còn dùng để so sánh tác dụng của thuốc trên các mô hình khác và đánh giá khả năng tiết acid dạ dày. Để giảm bớt thời gian nghiên cứu cũng như để tìm ra cơ chế của thuốc, một số tác giả đã phối hợp phương pháp thắt môn vị và một số phương pháp khác. Thắt môn vị dùng cùng acid, mô phỏng tình trạng hẹp môn vị kèm tăng tiết acid. Thắt môn vị có dùng thêm cồn mô phỏng tình trạng hẹp môn vị kèm suy giảm yếu tố bảo vệ. Hay, thắt môn vị đồng thời kẹp động mạch gây thiếu máu đã chứng minh thắt môn vị không chỉ làm chậm tháo rỗng dạ dày mà còn gây ứ trệ vi tuần hoàn, làm tổn thương mạch máu kèm theo thiếu máu. Các thuốc antacid, kháng H2, ức chế bơm proton, bảo vệ dạ dày đều có tác dụng trên mô hình này. Có thể lựa chọn thuốc đối chiếu trong mô hình này là antacid, ức chế bơm proton, kháng H2
hay sucralfat. Vì vậy, thuốc có tác dụng chống loét dạ dày trên thử nghiệm này tác dụng theo nhiều cơ chế khác nhau: antacid, ức chế bơm proton, kháng H2 hay bảo vệ (kắch thắch tiết prostaglandin và chất nhày). Từ kết quả ức chế loét của các thuốc đối chiếu ta có thể lựa chọn làm thuốc đối chiếu để so sánh với thuốc đang nghiên cứu. Nếu thuốc nghiên cứu cho kết quả tương đương
với thuốc chuẩn thì có thể thuốc đang nghiên cứu có cơ chế tác dụng như thuốc chuẩn. Trong điều kiện của Việt Nam, mô hình này hay được áp dụng do tiến hành đơn giản và kết quả nghiên cứu gợi ý cho các bước thử nghiệm tiếp theo.
* Các mô hình gây stress
Đây là mô hình thường được sử dụng tiếp theo, sau khi đã chứng minh thuốc có tác dụng chống loét dạ dày tá tràng. Kết quả sau một stress là tăng nồng độ corticoid, tăng enzym superoxidase dismutase, catalase, lipid peoxidase, đồng thời giảm sản xuất chất nhày, giảm tiết HCO3', giảm tổng hợp PG và NO. Trên mô hình gây loét cấp thì lượng corticoid lớn hcfn nhiều so với gây loét mạn. Sau một stress nhỏ liên tục (gây loét mạn), cơ thể tiết corticoid ắt và thắch nghi với lượng hormon này nên các phản ứng không ồ ạt, chỉ gây loét trợt nhỏ. Ngược lại, sau một stress mạnh và đủ dài thì lượng corticoid giải phóng với một lượng lớn, các phản ứng đáp ứng của cơ thể diễn ra mạnh mẽ gây một vết loét sâu, tổn thương mạch máu và biểu mô niêm mạc. Như vậy sau một stress, có tăng bài tiết acid (tăng yếu tố tấn công), tổn thương mạch máu, giảm tiết chất nhày, PG, NO (giảm yếu tố bảo vệ). Vì thế, mô hình gây stress cũng là một mô hình gây loét theo nhiều cách khác nhau, giảm yếu tố bảo vệ tăng yếu tố tấn công.
Ễ Mô hình gây stress bằng dòng điện kắch thắch có khả năng gây loét 40%. Thời gian thử nghiệm kéo dài nhưng hiệu quả không cao. Mặt khác với hiệu quả gây loét thấp như vậy chứng tỏ cho kết quả không ổn định. Vì vậy mô hình này hiện nay có ắt tác giả sử dụng nghiên cứu.
Ễ Mô hình gây stress bằng phương pháp gò bó (là mô hình gây ra
một stress tâm lý). Việc giam giữ chuột kéo dai) trong điều kiện thiếu ánh sáng là một stress đủ để gây loét thực nghiệm. Tiến hành giam giữ con vật trong bóng tối 24 giờ hoặc 1 2 giờ trong bóng tối 1 2 giờ ngoài ánh sáng và có khả năng gây loét từ 60- 100 %. Tuy nhiên, thử nghiệm này khá dài, gây bất tiện
cho người tiến hành thử nghiệm, đồng thời niêm mạc dạ dày có thời gian tự hồi phục, tăng sinh trở lại. Vì vậy việc đánh giá tác dụng của thuốc không còn chắnh xác.
Ễ Mô hình gây stress bằng nhúng trong nước lạnh (4- 6ổC), thời gian gây loét là 1 giờ, rút ngắn hơn mô hình trước, hiệu quả gây loét là từ 90-
100%, nên có thể gây một loét cấp. Việc đánh giá tác dụng của thuốc trên mô hình này một cách chắnh xác hơn mô hình trên do loại trừ được sự tự tăng sinh và liền vết loét niêm mạc. Mặt khác khoảng dao động bé nên kết quả ổn định và hay được áp dụng trong nghiên cứu. Như vậy, mô hình hay được áp dụng vì thuận tiện và cho kết quả tin cậy. Một số tác giả đã cải tiến bằng cách kết hợp giữa gây stress nhúng trong nước lạnh và giam giữ con vật. Hiệu quả gây loét là 100% và thời gian thực hiện thắ nghiệm trong 1-2 giờ. Với mô hình cải tiến này, có thể rút ngắn thời gian thử nghiệm, độ ổn định cao, lại cho kết quả tin cậy. Do đó, mô hình cải tiến này cũng là một trong những mô hình hay được áp dụng.
Thuốc đối chiếu được sử dụng trên mô hình này có thể thuộc nhóm antacid, kháng H2, ức chế bơm proton, bao vết loét, bảo vệ. Việc lựa chọn thuốc đối chiếu là quan trọng. Vì để tìm ra cơ chế tác dụng của thuốc nghiên cứu thì phải tiến hành so sánh kết quả chống loét giữa hai lô thử và lô đối chiếu. Nếu kết quả cho là tương tự thì có thể nhận định thuốc nghiên cứu có cơ chế tương tự như thuốc đối chiếu. Như vậy, trên mô hình gây stress có thể tìm ra cơ chế tác dụng của thuốc theo cơ chế: bảo vệ (kắch thắch tăng sinh chất nhày, dọn gốc tự do, Imi thông vi tuần hoàn tương tự misoprostol), kháng H2, ức chế bơm proton, antacid thậm chắ là an thần để ức chế loét.
* Gây loét bằng kẹp động mạch gây thiếu máu- tái truyền dịch
Kẹp động mạch dẫn đến thiếu máu, thiếu oxy ở mô, tăng tốc độ tạo gốc tự do kết quả là gây loét dạ dày tá tràng. Mô hình này đã chứng tỏ thiếu máu có thể gây loét dạ dày tá tràng. Hiệu quả gây loét của mô hình này tương tự
như mô hình gây stress- nhúng trong nước lạnh đạt 90- 100%. Tình trạng loét còn phụ thuộc vào thời gian kẹp động mạch gây thiếu máu. Thiếu máu càng lâu thì khả năng gây hoại tử mô càng lớn, vết loét sâu hơn, rộng hofn. Thử nghiệm kẹp động mạch tái tưới máu cũng như trên mô hình dùng cồn, indomethacin, thiếu máu mạn đều có xuất hiện endothelin- 1 (chất gây co mạch làm giảm vi tuần hoàn và gây loét). Để tăng hiệu quả gây loét cũng như tìm ra cơ chế tác dụng của thuốc, các tác giả đã cải tiến phương pháp bằng cách kết hợp kẹp động mạch với nhiều mô hình khác. Các mô hình kết hợp hay được áp dụng là kẹp động mạch với dùng acid, NSAIDS, cồn. Kẹp động mạch kết hợp với dùng acid mô phỏng trên những bệnh nhân có thiếu máu, tăng tiết acid. Kẹp động mạch dùng thêm NSAIDs, cồn sẽ làm giảm mạnh yếu tố bảo vệ. Kết quả sự phối hợp này là càng làm tăng yếu tố tấn công và giảm yếu tố bảo vệ của cơ thể theo nhiều cách khác nhau. Do đó, thuốc tác dụng trên mô hình thiếu máu do kẹp động mạch tạng có thể có cơ chế là antacid, ức chế bơm proton, bao vết loét, bảo vệ (tăng tiết prostaglandin, NO, chất nhày, chống oxy hóa). Thời gian tiến hành trên mô hình kẹp động mạch cũng như trên mô hình cải tiến rút ngắn đồng thời cho kết quả ổn định. Nên đây cũng là một trong những mô hình thường hay được áp dụng trong các thử nghiệm. Tuy nhiên, kĩ thuật tìm động mạch tạng và kẹp sao cho không bị vỡ mạch là một kĩ thuật khó, nên trong điều kiện của Việt Nam vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu sử dụng mô hình này.
4.1.3. Phương pháp gây loét bằng tác nhân hóa học
* Mô hình gây loét bằng acid
Dùng acid để gây loét là mô hình phổ biến hay được áp dụng cả trong nước và trên thế giới.
Ễ Gây loét bằng acid HCl là mô phỏng trên những bệnh nhân có tăng tiết acid. Nồng độ acid sử dụng càng cao thì khả năng gây loét càng lớn, đồng
Tuy nhiên các nhà nghiên cứu ắt khi sử dụng đơn độc tác nhân gây loét là acid mà thông thường phối hợp với một số chất gây loét khác hay phối hợp với các mô hình khác như: dùng acid kèm thắt môn vị, dùng acid kết hợp với cồn, dùng acid với kẹp động mạch hay phối hợp hỗn hợp. Tất cả sự phối hợp này nhằm mục đắch giảm pH dạ dày, tăng các yếu tố tấn công, giảm yếu tố bảo vệ cuối cùng là gây loét nhanh, cho kết quả ổn định và có thể đánh giá cơ chế tác dụng của thuốc dễ dàng hơn. Thuốc đối chiếu sử dụng cho mô hình này có thể là antacid, bạo vết loét, kháng H2, ức chế bơm proton. Kết quả thu được về tác dụng dạ dày của thuốc nghiên cứu kết hợp với kết quả mô hình Shay có thể đưa ra nhận định rõ hơn về cơ chế tác dụng của thuốc.
Như vậy, sử dụng acid HCl có thể gây mô hình loét cấp và tác dụng của thuốc trên mô hình này có thể có cơ chế: antacid, bao vết loét, ức chế bơm proton, kháng thụ thể Hj.
Ễ Gây loét mạn bằng acid acetic
Mô hình này mô phỏng trên những bệnh nhân có loét mạn tắnh, vết loét lâu liền sau đợt điều trị loét cấp. Thử nghiệm này dùng để đánh giá khả năng kắch thắch sự tái sinh biểu mô, niêm mạc dạ dày của thuốc. Thắ nghiệm này cho thấy vai trò của yếu tố tăng trưởng ở biểu mô đóng vai trò quan trọng trong quá trình liền loét, tự khỏi khi không dùng thuốc. Thuốc đối chiếu dùng trong mô hình này là những thuốc có khả năng làm liền sẹo như nhóm thuốc ức chế bơm proton, sucralfat... Mô hình này được ứng dụng để nghiên cứu chứng minh thuốc có tác dụng làm liền loét trên vết loét mạn. Đây là mô hình hay được áp dụng nghiên cứu tác dụng điều trị loét dạ dày tá tràng mạn tắnh của thuốc.
* Gây loét bằng cồn
Nồng độ cồn khác nhau có khả năng gây tổn thương niêm mạc với mức độ khác nhau và mức độ nhẹ nhất là xung huyết. Dựa trên mô hình gây loét bằng cồn ở những nồng độ khác nhau để đánh giá ảnh hưởng nồng độ cồn đến
loét. Giovanoni và cộng sự đã tiến hành thử trên chuột (n=18) chia làm 3 nhóm, đều làm tổn thương bằng vết mổ chuẩn. Sau đó trong 6 ngày liên tục được đưa vào dạ dày mỗi lần 1 ml nước cất (nhóm chứng), 1 ml ethanol 11,8%, 1 ml ethanol 43% (rượu Wisky). Sau đó giết vào ngày thứ 7, và kết quả là cả 2 nhóm niêm mạc ruột tiếp xúc với rượu (soi dưới kắnh hiển vi) đều có tổn thương loét, không lành ở vết khâu với mức độ nặng nhẹ tùy vào nồng độ rượu [48]. Sự tiêu thụ rượu ở mức hợp lý, vừa phải, có tác dụng tốt cho hoạt động chức năng ống tiêu hóa, vắ dụ làm tăng lưu lượng vi tuần hoàn tăng tiết dịch, tăng khả năng hấp thu. Nhưng ở nồng độ cồn cao (>50%) có khả năng gây tổn thương bề mặt niêm mạ. Nồng độ cồn càng cao thì khả năng gây tổn thương bề mặt niêm mạc càng lớn. Vì nồng độ cồn càng cao thì càng làm giảm lượng chất nhày trong dạ dày, giảm sản xuất prostaglandin, NO, bicarbonat, tăng sản xuất chất gây co mạch endothelin- 1 (gây thiếu máu, giảm lượng oxy đến mô, hoại tử mô). Trong các thử nghiệm dùng cồn đơn độc, nếu dùng nồng độ cồn 50% thì sẽ gây tổn thương sau 12 giờ, còn nếu dùng nồng độ cồn từ 70-95% thì tạo vết loét sau 1-2 giờ. Thông thường trong