3. MÔ HỉNH NGHIÊN cứu TÁC DỤNG CHỐNG LOÉT DẠ DầY
3.1.1 Nghiên cứu tác dụng kháng acid
Nhiều thập kỷ qua, thuốc kháng acid là một trong những thuốc điều trị loét dạ dày tá tràng [21]. Tác dụng chắnh của nhóm thuốc này là khả năng trung hòa acid. Do có bản chất là base, thuốc vào dạ dày sẽ phản ứng với acid HCl tạo muối trung hoà, tăng pH dịch vị, hạn chế sự tấn công của acid và pepsin. Do đó, thuốc ức chế loét dạ dày tá tràng. Để đánh giá hiệu lực trung hòa của các antacid có thể tiến hành trên thắ nghiệm in-vitro [50].
* Nguyên tắc
Đỗ Minh Quang và cộng sự (2000) đã khảo sát khả năng trung hòa acid bằng phương pháp định lượng thừa trừ. Khả năng trung hòa acid là lượng acid HCl 1 N mà 1 đơn vị thuốc có thể đưa pH của dạ dày đến pH 3,5 trong 15 phút [30].
* Cách tiến hành
Cân chắnh xác khối lượng 20 viên thuốc nghiên cứu, nghiền nhỏ thành bột mịn. Cân chắnh xác khối lượng bột tương đương 1 viên cho vào bình nón. Thêm vào bình nón 70 ml nước, khuấy từ trong 1 phút. Dùng pipet hút chắnh xác 30 ml dung dịch HCl 1 N (thừa) cho vào bình nón và khuấy từ trong 15 phút. Định lượng HCl IN thừa bằng dung dịch NaOH 0,5N đến pH 3,5.
* Cách đánh giá
Khả năng trung hòa acid = Vhci - VNaOH (mEq/viên).
^NaOH là thể tắch của dung dịch NaOH 0,5N để trung hòa HCl IN dư. Vhci là thể tắch của dung dịch HCl IN trong thử nghiệm [30, 50].
3.1.2. Nghiên cứu khả năng ức chê hoạt động pepsin
* Nguyên tắc
Pepsin tiếp xúc với albumin trứng (được đun chắn) khi đó albumin sẽ bị thủy phân. Xác định hoạt độ của pepsin bằng lượng albumin bị thủy phân. Khi cho một lượng thuốc xác định ức chế hoạt động pepsin, thì lượng albumin bị thủy phân sẽ bị giảm so với khi không dùng thuốc. Từ kết quả thu được suy ra khả năng ức chế hoạt động pepsin của thuốc.
* Cách tiến hành
- Cho vào 3 ống nghiệm;
ống 1: dung dịch protein, dung dịch HCl, nước cất. ống 2: dung dịch HCl, nước cất, dịch vị.
ống 3: dung dịch protein, dung dịch HCl, dịch vị, - Đặt vào tủ ấm 37ổc trong 1 giờ.
- Cho thêm vào mỗi ống dung dịch CCI3COOH (làm biến tắnh protein),
lắc kỹ, ly tâm lấy tủa.
- Cho vào mỗi ống gồm thuốc thử Gomal, nước cất. Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Đem đo quang 3 mẫu ở ^ = 530 nm. Thu được mật độ quang tương ứngE j,E2, E3 [6].
Theo Đỗ Minh Quang đã tiến hành cân lượng albumin trứng làm đông vón bằng cách đun chắn. Chia ra làm các lô thuốc thử, lô thuốc chuẩn. Pepsin điều chế từ dịch vị của lợn tiếp xúc với albumin trứng trong khoảng 2 giờ ở 37ổc. Cân khối lượng albumin trứng còn lại sau khi làm thủy phân [30]
* Cách đánh giá
Lượng protein bị thuỷ phân là:
Hoạt độ pepsin ứng với 100 ml dịch vị là: 100 X p.
3.1.3. Nghiên cứu tác dụng ức chế bơm proton
* Nguyên tắc
Các thuốc ức chế bơm proton có nhóm sulữiydryl, ở pH thấp hơn thì thuốc này tồn tại à dạng acid sulphenic và sulphenamide, chúng sẽ phản ứng với nhóm sulhydryl của enzym.
* Cách thực hiện
- Chuẩn bị protein màng cổ enzym H*/K^- ATPase
Các túi ở màng tế bào chứa enzym ATPase được lấy từ dạ dày lợn. Lợn để nhịn đói qua đêm rồi giết lấy dạ dày, niêm mạc dạ dày đem rửa bằng nước muối sinh lý lạnh trong 3- 5 phút. Tế bào niêm mạc đem nghiền đồng thể trong dung dịch saccarose 0,25M nhờ máy làm đồng nhất với lực li tâm 20.000g trong 40 phút. Loại bỏ phần lắng hạt, phần tỷ trọng thấp phắa trên đem quay li tâm lại với lực li tâm 75.000g trong Igiờ. Thu lấy phần lắng hạt và đem nghiền đồng thể trong dung dịch saccarose 0,25 M. Đem dung dịch đồng thể này li tâm với lực li tâm 75,000g trong 1 giờ ở 4ợc, phân tách lấy khoảng nồng độ protein màng từ 50- 75 mg. Proetin màng tế bào được bảo quản ở -70ổc để duy trì sự ổn định hoạt tắnh.
- Đánh giá hoạt lực của WIK*- ATPase thông qua khả năng giải phóng phosphat vô cơ (Pị) từ ATP ở 37ổc. Thuốc thử và thuốc đối chiếu (omeprazol) được đưa vào dung dịch đệm trước phản ứng có nồng độ enzym từ 0,0 1- 1 0 0 ,0
|iM ủ trong 30 phút ở 37ổc. Chuẩn bị song song hai mẫu dung dịch đệm có pH
6 và pH 7,4 để so sánh. Dung dịch đệm có pH 6 sau đó được điều chỉnh về pH 7,4 bằng dung dịch đệm HEPES/Tris. Phản ứng của enzym được khởi động khi cho chất nigericin và Tris/ATP. Tổng thể tắch phản ứng là 1 ml chứa 20 |ig protein màng, MgCl2 4 mM, KCl 10 mM, nigericin 20 ỊiM, Tris- ATP 2mM, HEPES 10 mM riêng dung dịch có pH 6 có thêm Pipes 2 mM trước phản ứng.
Để phản ứng diễn ra trong 4 phút ở 37ổc, rồi dừng phản ứng bằng cách cho thêm 10 ml dung dịch acid tricloroacetic 50%. Làm biến tắnh protein và
thu lấy Pị đem định lượng bằng phương pháp định lượng thừa trừ phosphomolypdat, định lượng phosphomolypdat bằng p- methyl-aminophenol trong dung dịch đồng Sulfat (Lebel và cộng sự - 1978) hoặc dựa vào phản ứng của phosphomolypdat với chất màu base green (Carter và cộng sự- 1982).
Lee và Forte (1978), Beil và cộng sự (1990) đã đề xuất định lượng proton trên niêm mạc dạ dày bằng chất phát huỳnh quang acridine orange. 0,12 mg protein màng được ủ ở 37ổc trong 2 ml dung dịch nuôi gồm: chất đệm Pipes/Tris 10 mM, pH 7,0, có KCl 150mM, MgCl22 mM, ATP2 mM, và acridine orange lOịaM. Bơm proton bắt đầu phản ứng khi cho thêm valinomycin (ionophore). Sau đó định lượng chất phát quang bằng phương
pháp đo huỳnh quang.
* Cách đánh giá
- Dựa trên nồng độ Pj giải phóng để đánh giá hoạt lực của enzym khi đã bị thuốc ức chế.
- Xác định giá trị IC50 (nồng độ thuốc ức chế 50% bơm proton) ở pH 6
và pH 7,4. So sánh các giá trị IC50 của thuốc thử và thuốc chuẩn. Đánh giá hiệu lực của thuốc so sánh với thuốc chuẩn [50].
3.1.4. Nghiên cứu tác dụng kháng cholinergic
* Nguyên tắc
Trên tế bào thành có receptor M) của acetylcholin, có vai trò quan trọng trong kắch thắch tiết acid. Để đánh giá khả năng tác dụng của thuốc mạnh hay yếu chọn lọc hay không chọn lọc, người ta thường hay định lượng phần thuốc gắn đặc hiệu lên receptor bằng phương pháp nguyên tử đánh dấu. Thắ nghiệm được tiến hành trên một số cơ quan của cơ thể sinh vật nơi có nhiều receptor của hệ muscarinic (não, niêm mạc đường tiêu hóa, tim).
Luthin và Wolfe (1984), El- Fakahani và cộng sự (1986) đã sử dụng não chuột để nghiên cứu các receptor của acetylcholin. Buckley và cộng sự (1989) đã tiến hành nhân bản vô tắnh gen của receptor muscarinic trên tế bào trứng
chuột đồng hoặc có thể được nhân bản vô tắnh trong ống nghiệm (Kashihara và cộng sự, 1992) [50].
* Cách thực hiện
- Chuẩn bị plasmid mang DNA
5 loại DNA mã hóa cho 5 loại receptor của hệ muscarinic ĩĩii, m2, ni3, ni4, ƯỉỊ được lấy từ ngân hàng gen người. Những vòng DNA này được truyền vào plasmid (vector) Okayama/berg pCD hoặc pCD-PS. Sau đó plasmid mang DNA được phân lập (Maniatis và cộng sự - 1982).
- Nuôi cấy tế bào
Tế bào trứng chuột đồng được ủ ở 37 ổc trong điều kiện áp suất bình thường (5% CO2) có 1 0% huyết thanh bê, 1 0 0 Ul/ml kháng sinh (penicilin G và steptomycin), 4mM glutamine.
- Quá trình truyền DNA
Truyền vector vào tế bào bằng phương pháp calcium phosphate có sử dụng chất dẫn truyền chọn lọc pcDneo (theo Chen và Okayama 1987). Chuẩn bị dòng tế bào vô tắnh đã truyền đoạn gen mã hóa receptor để gắn [H^] NMS (N- methylscopolamine HCl) (chất có gắn nguyên tố phóng xạ).
- Chuẩn bị lớp protein màng chứa các receptor của acetylcholin
Khi lượng tế bào phát triển khoảng 80% thì đem đồng thể hoá trong dung dịch đệm 30 phút bằng máy nghiền đồng thể. Dịch thu được dem quay li tâm với lực li tâm 16.000 g trong 15 phút, thu lấy phần màng tế bào lắng ở dưới và đem nghiền đồng thể lại. Màng tế bào trước khi sử dụng được bảo quản ở - 80ổc.
- Quá trình gắn vào thụ thể
Màng tế bào, thuốc, ligand phóng xạ đưa vào 1 ml dung dịch đệm (gồm Na phosphat 25 mM (pH 7,4), MgCl 5 mM). Chuẩn bị 5 mẫu màng tế bào có nồng độ tưcmg ứng là: mi 6|ig/ml; m2l0|j.g/ml; 1TI3 5|ig/ml; ni4 3Ịig/ml); m<5 4|0,g/ml. Trong thắ nghiệm dùng toàn bộ [H^] NMS, sử dụng 8 -1 0 nồng độ
chất gắn (ligand) khác nhau (có nồng độ thay đổi từ 2- 1400pM). Trong một thắ nghiệm khác, sử dụng [tf ] NMS 150pM và 10 nồng độ khác nhau của chất gắn thay thế. Sự gắn đặc hiệu được xác định bằng khả năng gắn khác nhau của [H^] NMS khi có hay không có lịiM atropin. Để ở 22ổc trong 3 giờ, quá trình gắn vào thụ thể xảy ra rồi lọc qua màng lọc. Màng tế bào thu được đem rửa 3 lần, mỗi lần 5 ml dung dịch đệm lạnh và làm khô. Chuyển màng tế bào vào lOml dung dịch phát quang và phát hiện bằng máy đếm nguyên tử đánh dấu LKB P- counter.
* Cách đánh giá
Tắnh phần trăm [H^] NMS gắn trong thắ nghiệm chất này bão hòa.
Tắnh phần trăm [H^] NMS gắn trong thắ nghiệm có sử dụng chất gắn thay thế. Tắnh IC50 (nồng độ của chất gắn đặc hiệu khi ức chế 50% thụ thể).
Từ đó đánh giá khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể, đồng thời đánh giá mức độ cạnh tranh acetylcholin trên thụ thể muscarinic, mức độ ức chế tiết acid [50].
3.1.5. Nghiên cứu tác dụng ức chê Helỉcobacter pylori trên in- vitro
* Nguyên tắc
Dựa trên test thử kháng sinh đồ, xác định MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của thuốc trên H.p trong môi trường thạch máu. Đo vòng vô khuẩn rồi so sánh với thuốc chứng.
* Cách tiến hành
- Nuối cấy vi khuẩn H.p
H.p được phân lập và nuôi cấy từ mẫu mô sinh thiết niêm mạc hang vị dạ dày- tá tràng của bệnh nhân. Mẫu mô được nghiền nát giữa hai miếng lam vô trùng, bệnh phẩm được cấy bằng que bông đưa vào các hộp thạch chứa môi trường giàu dinh dưỡng (thạch agar, 7% máu cừu, 4% huyết thanh bào thai bê, amphotericin B 20 mg/ml, acid nalidixic 10 mg/ml, vancomycin 3 mg/ml. Các
được đem thử các phản ứng hóa sinh urease, catalase, oxydase để xác định vi khuẩn. Chọn khuẩn lạc mọc tốt, hoạt hóa trong môi trường dinh dưỡng rồi pha loãng đến nồng độ vi khuẩn khoảng 100 vi khuẩn/ ml để thử nghiệm MIC. -Thử MIC của thuốc
+ Pha thuốc thành các nồng độ khác nhau từ cao xuống thấp.
+ Thử tác dụng của thuốc trên H.p: cho vào hộp thạch có thuốc (thuốc thử, thuốc chuẩn, chứng) với 1 ml (nồng độ khoảng 1 0 0 vi khuẩn/ml) chủng H.p đã hoạt hóa. Các hộp thạch được ủ ở 37ợc trong môi trường hiếu khắ và đọc kết quả sau 24 giờ. Xác định giá trị MIC của thuốc thử và thuốc chuẩn, so sánh để đánh giá tác dụng mạnh yếu, ức chế hay không ức chế của thuốc đang nghiên cứu [29]
3.2. Nghiên cứu in-vivo
Dựa trên những nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh bệnh loét dạ dày tá tràng, các mô hình gây loét thực nghiệm đã mô phỏng điều kiện, nguyên nhân gây loét và tạo ra một tình trạng bệnh gần giống trong thực tế. Từ đó, nhà nghiên cứu đánh giá tác dụng chống loét dạ dày tá tràng và cơ chế tác dụng của thuốc mới theo từng mô hình.
3.2.1. Mô hình gây loét bằng phưofng pháp vật lý
3.2.1.1. Mô hình thắt môn vị (mô hình Shay) trên chuột
* Nguyên tắc
Shay và cộng sự (1945) đã đề xuất phương pháp thắt môn vị trên chuột cống. Đây là phương pháp mô phỏng tình trạng tăng tiết acid cũng như làm chậm tháo rỗng dạ dày tương tự bệnh hẹp mồn vị, từ đó gây loét dạ dày tá tràng [17, 50].
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng cân nặng từ 150- 170 g, chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý.
- Lô 2 (lô đối chiếu): dùng một thuốc đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
Trước ngày uống liều thuốc cuối cùng, chuột để nhịn đói 24- 48 giờ nhưng vẫn cho uống nước trước khi làm thực nghiệm. Gây mê chuột, mở ổ bụng bộc lộ môn vị dạ dày chuột. Dùng chỉ phẫu thuật thắt môn vị (tránh thắt vào động mạch tạng), rồi khâu đóng thành bụng. Sau đó, các lô chuột được uống nước muối sinh lý, thuốc đối chiếu và thuốc nghiên cứu. Sau 19 giờ, giết chuột, mở ổ bụng, cắt phần dạ dày ra khỏi ổ bụng. Dịch vị trong dạ dày được đo thể tắch và quay li tâm để xác định độ acid bằng NaOH 0,1N. Dạ dày được mở dọc theo bờ cong lớn, rửa bằng nước muối sinh lý, thấm khô và cố định trên đĩa. Niêm mạc dạ dày được soi dưới kắnh hiển vi để kiểm tra mức độ tổn thương. Các vết loét thường xuất hiện nhiều ở dạ dày và hang vị [50].
* Cách đánh giá
- Mức độ tổn thương:
Đếm số vết loét và đánh giá mức độ tổn thương theo phương pháp tắnh điểm;
+ 0: không loét.
+ 1: vết loét nông, loét bề mặt. + 2: các vết loét sâu.
+ 3: loét thủng niêm mạc.
- Chỉ số loét Uj được tắnh theo công thức:
Ui= U n + Us + Up X 10-*
U^: số lượng vết loét trung bình trên một con vật Ug: số điểm loét trung bình
Upi phần trăm chuột bị loét - Thể tắch dịch vị:
Thông số đánh giá là số ml dịch vị toàn phần tắnh trên 100 g động vật thắ nghiệm (ml/lOOg). V V = ^ X Ỉ 0 0 m V: thể tắch dịch vị (ml).
Vtpi thể tắch dịch vị toàn phần thu được (ml), m: trọng lượng chuột (g)
Độ acid dịch vị:
+ Độ acid tự do; Số ml dung dịch NaOH 0,1 N trung hòa lượng acid tự do có trong 1 0 ml dịch vị (ml/ 1 0 ml).
+ Độ acid toàn phần: Số ml dung dịch NaOH 0,1 N trung hòa lượng acid HCl toàn phần có trong 10 ml dịch vị (ml/10 ml).
ậ = ^ x l O A = Ồ ^10
n n
Ajắ độ acid tự do Aị: độ acid toàn phần
n: thể tắch dịch vị đem định lượng
n,: thể tắch dung dịch NaOH 0,1 N trung hoà HCl tự do Rị: thể tắch dung dịch NaOH 0,1 N trung hoà HCl toàn phần + Mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng:
T.
U: mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng (%)
T^: tỉ lệ loét ở lô chứng (%) T,: tỉ lệ loét ở lô thử (%)
So sánh thống kê các thông số: chỉ số loét, thể tắch dịch vị và độ acid dịch vị giữa các lô dùng thuốc với lô chứng, giữa lô thử và đối chiếu.
Mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng càng cao chứng tỏ thuốc có tác dụng chống loét càng tốt.
3.2.I.2. Mô hình gây loét bằng stress.
* Nguyên tắc
Các nhà nghiên cứu kết luận stress có thể gây loét dạ dày. Nhiều quan sát trên lâm sàng cho thấy các yếu tố tâm lý xã hội có thể góp phần là nguyên nhân gây nên loét dạ dày tá tràng (người dân ở thành thị có tỷ lệ mắc bệnh loét cao hơn ở nông thôn; bệnh loét cũng tăng ở nhóm nghề nghiệp với mức độ áp lực xã hội cao). Theo nghiên cứu của Selye, khi gây một stress thì ngay sau đó cơ thể phản ứng lại bằng cách co mạch máu, giảm trương lực cơ, giảm glucose, giảm bạch cầu, sau đó sẽ gây tăng tiết ACTH (tuyến yên) và corticosteroid (hormon vỏ thượng thận). Như vậy, sau một stress thì cơ thể xuất hiện một loạt các phản ứng để chống stress và kết quả là tạo ra các hormon có tác dụng gây loét, giảm yếu tố bảo vệ dạ dày (giảm dòng máu tuần hoàn tại dạ dày, giảm tiết chất nhày, giảm tiết prostaglandin). Trên thực nghiệm, các tác giả đã dùng nhiều phương pháp gây stress khác nhau để gây loét dạ dày [6, 22, 46].
> Gây stress bằng cách giữ cố định con vật thắ nghiệm (phương pháp gò bó)
Selye (1936) là người đầu tiên giới thiệu mô hình này, sau đó được cải tiến bởi các tác giả Hanson và Brodie (1960), Bofitls và cộng sự (1966). Gây stress bằng cách gò bó, con vật có tình trạng tương tự như bị một stress kéo dài.
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng nặng 150- 170g, chia ngẫu nhiên thành các lô: