3. MÔ HỉNH NGHIÊN cứu TÁC DỤNG CHỐNG LOÉT DẠ DầY
3.1.4. Nghiên cứu tác dụng kháng cholinergic
* Nguyên tắc
Trên tế bào thành có receptor M) của acetylcholin, có vai trò quan trọng trong kắch thắch tiết acid. Để đánh giá khả năng tác dụng của thuốc mạnh hay yếu chọn lọc hay không chọn lọc, người ta thường hay định lượng phần thuốc gắn đặc hiệu lên receptor bằng phương pháp nguyên tử đánh dấu. Thắ nghiệm được tiến hành trên một số cơ quan của cơ thể sinh vật nơi có nhiều receptor của hệ muscarinic (não, niêm mạc đường tiêu hóa, tim).
Luthin và Wolfe (1984), El- Fakahani và cộng sự (1986) đã sử dụng não chuột để nghiên cứu các receptor của acetylcholin. Buckley và cộng sự (1989) đã tiến hành nhân bản vô tắnh gen của receptor muscarinic trên tế bào trứng
chuột đồng hoặc có thể được nhân bản vô tắnh trong ống nghiệm (Kashihara và cộng sự, 1992) [50].
* Cách thực hiện
- Chuẩn bị plasmid mang DNA
5 loại DNA mã hóa cho 5 loại receptor của hệ muscarinic ĩĩii, m2, ni3, ni4, ƯỉỊ được lấy từ ngân hàng gen người. Những vòng DNA này được truyền vào plasmid (vector) Okayama/berg pCD hoặc pCD-PS. Sau đó plasmid mang DNA được phân lập (Maniatis và cộng sự - 1982).
- Nuôi cấy tế bào
Tế bào trứng chuột đồng được ủ ở 37 ổc trong điều kiện áp suất bình thường (5% CO2) có 1 0% huyết thanh bê, 1 0 0 Ul/ml kháng sinh (penicilin G và steptomycin), 4mM glutamine.
- Quá trình truyền DNA
Truyền vector vào tế bào bằng phương pháp calcium phosphate có sử dụng chất dẫn truyền chọn lọc pcDneo (theo Chen và Okayama 1987). Chuẩn bị dòng tế bào vô tắnh đã truyền đoạn gen mã hóa receptor để gắn [H^] NMS (N- methylscopolamine HCl) (chất có gắn nguyên tố phóng xạ).
- Chuẩn bị lớp protein màng chứa các receptor của acetylcholin
Khi lượng tế bào phát triển khoảng 80% thì đem đồng thể hoá trong dung dịch đệm 30 phút bằng máy nghiền đồng thể. Dịch thu được dem quay li tâm với lực li tâm 16.000 g trong 15 phút, thu lấy phần màng tế bào lắng ở dưới và đem nghiền đồng thể lại. Màng tế bào trước khi sử dụng được bảo quản ở - 80ổc.
- Quá trình gắn vào thụ thể
Màng tế bào, thuốc, ligand phóng xạ đưa vào 1 ml dung dịch đệm (gồm Na phosphat 25 mM (pH 7,4), MgCl 5 mM). Chuẩn bị 5 mẫu màng tế bào có nồng độ tưcmg ứng là: mi 6|ig/ml; m2l0|j.g/ml; 1TI3 5|ig/ml; ni4 3Ịig/ml); m<5 4|0,g/ml. Trong thắ nghiệm dùng toàn bộ [H^] NMS, sử dụng 8 -1 0 nồng độ
chất gắn (ligand) khác nhau (có nồng độ thay đổi từ 2- 1400pM). Trong một thắ nghiệm khác, sử dụng [tf ] NMS 150pM và 10 nồng độ khác nhau của chất gắn thay thế. Sự gắn đặc hiệu được xác định bằng khả năng gắn khác nhau của [H^] NMS khi có hay không có lịiM atropin. Để ở 22ổc trong 3 giờ, quá trình gắn vào thụ thể xảy ra rồi lọc qua màng lọc. Màng tế bào thu được đem rửa 3 lần, mỗi lần 5 ml dung dịch đệm lạnh và làm khô. Chuyển màng tế bào vào lOml dung dịch phát quang và phát hiện bằng máy đếm nguyên tử đánh dấu LKB P- counter.
* Cách đánh giá
Tắnh phần trăm [H^] NMS gắn trong thắ nghiệm chất này bão hòa.
Tắnh phần trăm [H^] NMS gắn trong thắ nghiệm có sử dụng chất gắn thay thế. Tắnh IC50 (nồng độ của chất gắn đặc hiệu khi ức chế 50% thụ thể).
Từ đó đánh giá khả năng gắn đặc hiệu vào thụ thể, đồng thời đánh giá mức độ cạnh tranh acetylcholin trên thụ thể muscarinic, mức độ ức chế tiết acid [50].
3.1.5. Nghiên cứu tác dụng ức chê Helỉcobacter pylori trên in- vitro
* Nguyên tắc
Dựa trên test thử kháng sinh đồ, xác định MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của thuốc trên H.p trong môi trường thạch máu. Đo vòng vô khuẩn rồi so sánh với thuốc chứng.
* Cách tiến hành
- Nuối cấy vi khuẩn H.p
H.p được phân lập và nuôi cấy từ mẫu mô sinh thiết niêm mạc hang vị dạ dày- tá tràng của bệnh nhân. Mẫu mô được nghiền nát giữa hai miếng lam vô trùng, bệnh phẩm được cấy bằng que bông đưa vào các hộp thạch chứa môi trường giàu dinh dưỡng (thạch agar, 7% máu cừu, 4% huyết thanh bào thai bê, amphotericin B 20 mg/ml, acid nalidixic 10 mg/ml, vancomycin 3 mg/ml. Các
được đem thử các phản ứng hóa sinh urease, catalase, oxydase để xác định vi khuẩn. Chọn khuẩn lạc mọc tốt, hoạt hóa trong môi trường dinh dưỡng rồi pha loãng đến nồng độ vi khuẩn khoảng 100 vi khuẩn/ ml để thử nghiệm MIC. -Thử MIC của thuốc
+ Pha thuốc thành các nồng độ khác nhau từ cao xuống thấp.
+ Thử tác dụng của thuốc trên H.p: cho vào hộp thạch có thuốc (thuốc thử, thuốc chuẩn, chứng) với 1 ml (nồng độ khoảng 1 0 0 vi khuẩn/ml) chủng H.p đã hoạt hóa. Các hộp thạch được ủ ở 37ợc trong môi trường hiếu khắ và đọc kết quả sau 24 giờ. Xác định giá trị MIC của thuốc thử và thuốc chuẩn, so sánh để đánh giá tác dụng mạnh yếu, ức chế hay không ức chế của thuốc đang nghiên cứu [29]
3.2. Nghiên cứu in-vivo
Dựa trên những nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh bệnh loét dạ dày tá tràng, các mô hình gây loét thực nghiệm đã mô phỏng điều kiện, nguyên nhân gây loét và tạo ra một tình trạng bệnh gần giống trong thực tế. Từ đó, nhà nghiên cứu đánh giá tác dụng chống loét dạ dày tá tràng và cơ chế tác dụng của thuốc mới theo từng mô hình.
3.2.1. Mô hình gây loét bằng phưofng pháp vật lý
3.2.1.1. Mô hình thắt môn vị (mô hình Shay) trên chuột
* Nguyên tắc
Shay và cộng sự (1945) đã đề xuất phương pháp thắt môn vị trên chuột cống. Đây là phương pháp mô phỏng tình trạng tăng tiết acid cũng như làm chậm tháo rỗng dạ dày tương tự bệnh hẹp mồn vị, từ đó gây loét dạ dày tá tràng [17, 50].
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng cân nặng từ 150- 170 g, chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý.
- Lô 2 (lô đối chiếu): dùng một thuốc đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
Trước ngày uống liều thuốc cuối cùng, chuột để nhịn đói 24- 48 giờ nhưng vẫn cho uống nước trước khi làm thực nghiệm. Gây mê chuột, mở ổ bụng bộc lộ môn vị dạ dày chuột. Dùng chỉ phẫu thuật thắt môn vị (tránh thắt vào động mạch tạng), rồi khâu đóng thành bụng. Sau đó, các lô chuột được uống nước muối sinh lý, thuốc đối chiếu và thuốc nghiên cứu. Sau 19 giờ, giết chuột, mở ổ bụng, cắt phần dạ dày ra khỏi ổ bụng. Dịch vị trong dạ dày được đo thể tắch và quay li tâm để xác định độ acid bằng NaOH 0,1N. Dạ dày được mở dọc theo bờ cong lớn, rửa bằng nước muối sinh lý, thấm khô và cố định trên đĩa. Niêm mạc dạ dày được soi dưới kắnh hiển vi để kiểm tra mức độ tổn thương. Các vết loét thường xuất hiện nhiều ở dạ dày và hang vị [50].
* Cách đánh giá
- Mức độ tổn thương:
Đếm số vết loét và đánh giá mức độ tổn thương theo phương pháp tắnh điểm;
+ 0: không loét.
+ 1: vết loét nông, loét bề mặt. + 2: các vết loét sâu.
+ 3: loét thủng niêm mạc.
- Chỉ số loét Uj được tắnh theo công thức:
Ui= U n + Us + Up X 10-*
U^: số lượng vết loét trung bình trên một con vật Ug: số điểm loét trung bình
Upi phần trăm chuột bị loét - Thể tắch dịch vị:
Thông số đánh giá là số ml dịch vị toàn phần tắnh trên 100 g động vật thắ nghiệm (ml/lOOg). V V = ^ X Ỉ 0 0 m V: thể tắch dịch vị (ml).
Vtpi thể tắch dịch vị toàn phần thu được (ml), m: trọng lượng chuột (g)
Độ acid dịch vị:
+ Độ acid tự do; Số ml dung dịch NaOH 0,1 N trung hòa lượng acid tự do có trong 1 0 ml dịch vị (ml/ 1 0 ml).
+ Độ acid toàn phần: Số ml dung dịch NaOH 0,1 N trung hòa lượng acid HCl toàn phần có trong 10 ml dịch vị (ml/10 ml).
ậ = ^ x l O A = Ồ ^10
n n
Ajắ độ acid tự do Aị: độ acid toàn phần
n: thể tắch dịch vị đem định lượng
n,: thể tắch dung dịch NaOH 0,1 N trung hoà HCl tự do Rị: thể tắch dung dịch NaOH 0,1 N trung hoà HCl toàn phần + Mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng:
T.
U: mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng (%)
T^: tỉ lệ loét ở lô chứng (%) T,: tỉ lệ loét ở lô thử (%)
So sánh thống kê các thông số: chỉ số loét, thể tắch dịch vị và độ acid dịch vị giữa các lô dùng thuốc với lô chứng, giữa lô thử và đối chiếu.
Mức độ ức chế loét của lô thử so với lô chứng càng cao chứng tỏ thuốc có tác dụng chống loét càng tốt.
3.2.I.2. Mô hình gây loét bằng stress.
* Nguyên tắc
Các nhà nghiên cứu kết luận stress có thể gây loét dạ dày. Nhiều quan sát trên lâm sàng cho thấy các yếu tố tâm lý xã hội có thể góp phần là nguyên nhân gây nên loét dạ dày tá tràng (người dân ở thành thị có tỷ lệ mắc bệnh loét cao hơn ở nông thôn; bệnh loét cũng tăng ở nhóm nghề nghiệp với mức độ áp lực xã hội cao). Theo nghiên cứu của Selye, khi gây một stress thì ngay sau đó cơ thể phản ứng lại bằng cách co mạch máu, giảm trương lực cơ, giảm glucose, giảm bạch cầu, sau đó sẽ gây tăng tiết ACTH (tuyến yên) và corticosteroid (hormon vỏ thượng thận). Như vậy, sau một stress thì cơ thể xuất hiện một loạt các phản ứng để chống stress và kết quả là tạo ra các hormon có tác dụng gây loét, giảm yếu tố bảo vệ dạ dày (giảm dòng máu tuần hoàn tại dạ dày, giảm tiết chất nhày, giảm tiết prostaglandin). Trên thực nghiệm, các tác giả đã dùng nhiều phương pháp gây stress khác nhau để gây loét dạ dày [6, 22, 46].
> Gây stress bằng cách giữ cố định con vật thắ nghiệm (phương pháp gò bó)
Selye (1936) là người đầu tiên giới thiệu mô hình này, sau đó được cải tiến bởi các tác giả Hanson và Brodie (1960), Bofitls và cộng sự (1966). Gây stress bằng cách gò bó, con vật có tình trạng tương tự như bị một stress kéo dài.
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng nặng 150- 170g, chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý.
- Lô 2 (lô đối chiếu): dùng một thuốc đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
Với mô hình gây loét cấp, chuột được uống thuốc chống loét dạ dày (thuốc thử và thuốc chuẩn) trước khi gây stress. Chuột để nhịn đói, không cho
uống nước trong 24 giờ trước khi uống thuốc lần cuối cùng. Sau khi uống thuốc lần cuối 30- 60 phút thì gây stress. Quá trình gây stress thực hiện như sau: gây mê chuột, nhốt vào lồng chật, chân treo ngược trong lồng. Đặt lồng chuột trong phòng tối ở nhiệt độ 20ổc trong 24 giờ. Với mô hình gây loét mạn, chuột bị gây stress trước khi uống thuốc lần cuối từ 30- 60 phút. Sau khi gây stress, giết chuột, tách lấy dạ dày chuột, tiêm vào dạ dày dung dịch formalin để trong 30- 60 phút. Mở dạ dày dọc theo bờ cong lớn, rửa dạ dày bằng nước ấm. Đem soi dạ dày dưới kắnh hiển vi để đánh giá mức độ tổn thương [41, 50, 55].
* Cách đánh giá
Chỉ số loét ƯJ được tắnh theo công thức:
Uj = Un + ư s + ư p X 1 0 - ‘
ư^: số vết loét trung bình tắnh trên một con vật
Uỷ số điểm trung bình
Upi tỷ lệ phần trăm con vật bị loét - Phương pháp tắnh điểm.
+ 0: không loét + 1: loét bề mặt
+ 2; loét sâu vào trong thành dạ dày + 3: loét thủng niêm mạc
So sánh chỉ số loét giữa các lô thuốc với lô chứng, giữa lô thử và lô đối chiếu bằng phương pháp thống kê.
> Gây stress bằng cách nhúng đột ngột trong nước lạnh (cold restraint stress)
Phương pháp này được Takagi và cộng sự (1964), West (1982) đề xuất. Nhúng con vật trong nước lạnh trong suốt quá trình làm thắ nghiệm, kết hợp với việc giữ cố định con vật trong một thời gian ngắn để gây nên tình trạng bị kắch thắch như một stress kéo dài.
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng cân nặng 150- 200 g, được chia ngẫu nhiên
thành các lô:
- Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý.
- Lô 2 (lô đối chiếu): dùng một thuốc chuẩn để đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
Chuột được uống thuốc thử trong vòng 6 -1 0 ngày trước khi làm thử nghiệm. Để chuột nhịn đói 18 giờ trước ngày uống thuốc cuối cùng. Chuột được giữ thẳng đứng trong chuồng rồi đưa vào nước lạnh ở 4- 6 ổc trong 1- 2 giờ. Nhúng xong để con vật khô ráo và tiêm vào tĩnh mạch đuôi dung dịch Evans blue liều 30 mg/kg.
Sau thắ nghiệm gây stress khoảng 10 phút- 2 giờ, giết chuột, tách rời dạ dày chuột. Tiêm vào dạ dày chuột dung dịch formalin (2%v/v) để qua đêm. Ngày hôm sau, mở dạ dày chuột dọc theo bờ cong lớn, rửa qua dạ dày bằng nước ấm, kiểm tra niêm mạc dạ dày dưới kắnh lúp [41, 50, 67, 72, 82].
Mô hình này cũng có thể thực hiện trên chuột nhắt trắng (Levine- 1971). Chuột để đói trong 36 giờ trước khi làm thực nghiệm. Trước khi gây stress 1 giờ, chuột được uống thuốc chống loét. Gây tress bằng cố định chuột trong nước lạnh ở 4ổc trong 4 giờ. Sau đó, giết chuột, tách lấy dạ dày đem soi dưới kắnh hiển đánh giá mức độ tổn thương [55].
* Cách đánh giá
Dựa trên các chỉ tiêu: số vết loét, độ dài vết loét trên mỗi con vật, tắnh tỷ lệ gây loét trong lô, chỉ số loét (như mục 3.2.1.1).
> Gây stress bằng cách kắch thắch điện
* Cách tiến hành
Sử dụng chuột cống trắng cân nặng 150- 200 g, được chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô 1 (lô chứng); uống nước muối sinh lý. - Lô 2 (lô đối chiếu): dùng một thuốc đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
Chuột cống bị kắch thắch bằng dòng điện một chiều có hiệu điện thế 5- 7 V, cứ 10 giây một lần, làm như thế trong 3- 5 giờ liền. Sau đó, giết chuột, lấy dạ dày khỏi ổ bụng, mở dạ dày dọc theo bờ cong lớn, kiểm tra dạ dày dưới kắnh hiển vi [27].
* Cách đánh giá
Kết quả được đánh giá dựa trên các chỉ số: tỷ lệ loét, chỉ số lo é t... (như mục 3.2.1.1)
3.2.1.3. Gây loét bằng kẹp động mạch tạng gây thiếu máu cục bộ- tái tưới máu
* Nguyên tắc
Vai trò bảo vệ dạ dày của mạch máu nuôi dạ dày là lấy đi ion và cung cấp các yếu tố làm liền loét. Trên thực tế, những bệnh nhân thiếu máu, bệnh nhân xơ gan cổ trướng thì tỷ lệ loét dạ dày là khá cao.
Hassan và cộng sự (1997) đã phát hiện thấy tình trạng thiếu máu cục bộ gây ảnh hưởng đến một số chất nội sinh, cụ thể là endothelin-1. Tương tự như sử dụng cồn, indomethacin và gây sốc thiếu máu, tình trạng thiếu máu cục bộ làm tăng sinh chất endothelin và gây ra loét dạ dày tá tràng (Masuda và cộng sự 1993; Kitajima và cộng sự 1993; Michda và cộng sự 1994) [50].
* Cách thực hiện
Sử dụng chuột cống trắng nặng 200- 250g, chia ngẫu nhiên thành các lô: - Lô 1 (lô chứng): uống nước muối sinh lý.
- Lô 2 (lô đối chiếu): dùng thuốc đối chiếu.
- Lô 3 (lô thử): dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống loét dạ dày tá tràng.
ỈJ
Cho chuột uống thuốc trong một khoảng thời gian từ 5- 10 ngày trước khi làm thực nghiệm. Sau khi uống liều gần cuối, để chuột nhịn đói trong 24 giờ nhưng vẫn được uống nước. Trước khi gây loét khoảng 30- 60 phút, chuột được cho uống liều cuối cùng. Gây mê chuột, sau đó phẫu thuật mở ổ bụng chuột, truyền vào dạ dày dung dịch HCl 0,15 M liều Iml/lOOg chuột. Kẹp động mạch trái dạ dày trong 5 phút để gây thiếu máu cục bộ và để 30 phút tái tưới máu sau khi bỏ kẹp ra. Giết chuột, mở dạ dày dọc theo bờ cong lớn rồi ngâm trong dung dịch formalin. Kiểm tra mức độ tổn thưoỉng bằng kắnh hiển