- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.3.1. Xác định 100% tán huyết của LLOE247M/D320K
Dùng các chất tẩy như SDS, triton hoặc muối có nồng độ cao để phá vỡ hoàn toàn một lượng tế bào hồng cầu. Sau đó, đo OD541nm để xác định lượng hemoglobin được giải phóng. Giá trị OD541nm đo được chính là 100% tán huyết của một lượng tế bào hồng cầu nhất định. Có nhiều chất được sử dụng để xác định 100% tán huyết, mỗi chất khi sử dụng đều có một hạn chế riêng. Do vậy, tiến hành khảo sát, thu nhận, đánh giá kết quả để bước đầu chọn hóa chất cho thí nghiệm đồng thời thu số liệu cho thí nghiệm 100% tán huyết.
Quy trình thực hiện
• Chuẩn bị dịch pha loãng tế bào máu cừu nồng độ 2.5%:
- Tế bào hồng cầu được rửa với buffer PBS pH 7.0 lạnh: huyền phù 5 ml tế bào máu cừu đậm đặc với 20 ml buffer PBS pH 7.0 lạnh. Ly tâm với tốc độ 1700g trong 5 phút ở 4°C. Thu lấy phần lắng tế bào, rửa 3 lần nữa với PBS pH 7.0, mỗi lần 25 ml buffer.
- Pha loãng phần cặn tế bào với PBS pH 7.0 lạnh để được dịch hồng cầu nồng độ 2.5%.
- Bảo quản trong tủ mát 4°C.
• Xác định 100% tán huyết bằng dung dịch Na2CO3 các nồng độ:
- Thực hiện pha loãng Na2CO3 với các nồng độ: 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1%.
- Đặt thí nghiệm: 1 ml mỗi nồng độ Na2CO3 pha loãng, thêm 0.5 ml dịch hồng cầu nồng độ 2.5%, đảo đều nhẹ nhàng.
- Ủ ở nhiệt độ 37°C trong 45 phút.
- Ly tâm với tốc độ 1700g trong 5 phút ở 4°C. - Lấy dịch nổi đo OD541nm ở mỗi nồng độ.
• Xác định 100% tán huyết bằng dung dịch SDS và Triton các nồng độ:
- Tương tự như thí nghiệm dùng Na2CO3, với các nồng độ dung dịch SDS: 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 %; nồng độ dung dịch Triton như sau: 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 %