- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.2.3. Tinh chế protein LLOE247M/D320K
Nguyên tắc
Sau phản ứng cắt, trong dung dịch mẫu chứa 3 thành phần cơ bản: Protein mục tiêu, đuôi LysSN-6xHis-TEVsite và TEV protease có đuôi 6xHis ở đầu N. Các thành phần có đuôi 6xHis sẽ bị mắc lại trên cột do có ái lực cao với Ni2+, protein mục tiêu đã bị loại bỏ đuôi 6xHis nên sẽ thông qua cột đi ra ngoài và được thu lại vào các phân đoạn (flow through).
Tuy nhiên, trước khi tiến hành phản ứng cắt, cần dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ các thành phần của phản ứng cắt có ảnh hưởng tới ái lực của đuôi 6xHis với Ni2+ như: EDTA. Đồng thời lợi dụng quá trình thẩm tích ở bước này, ta tăng nồng độ glycerol trong mẫu, thuận lợi cho bảo quản sau này.
Quy trình thực hiện
• Quy trình trao đổi dung dịch và loại bỏ đuôi dung hợp bằng cột Histrap:
- Cho hỗn hợp sản phẩm cắt vào cột thẩm tích.
- Chuyển cột thẩm tích vào dung dịch lưu trữ PIPES pH 6.0 có bổ sung 18% glycerol, thực hiện thẩm tích 2 lần, mỗi lần 30 phút.
- Toàn bộ dung dịch sau thẩm tích cho chảy qua cột, thu lại dịch protein qua cột theo các phân đoạn.
- Rửa cột bằng dung dịch EBW.
- Tiến hành dung ly bằng dung dịch dung ly để thu lại các thành phần đã bám trên cột.
- Thu 20 µl mẫu các dung dịch chứa protein trước qua cột, sau qua cột, rửa cột và dung dịch dung ly để chạy SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của protein cũng như hiệu quả hoạt động của emzyme cắt.
• Quy trình chạy SDS-PAGE kiểm tra kết quả cắt:
- Các bước tương tự như kiểm tra mẫu protein trước qua cột, sau qua cột, rửa và các phân đoạn dung ly ở bước thu nhận protein dung hợp.
- Sau khi thu nhận được protein từ các phân đoạn, tiến hành đo Nanodrop® xác định nồng độ protein thu được.
• Quy trình bảo quản Protein LLOE247M/D320K:
- Sau khi kiểm tra kết quả bằng SDS-PAGE, mẫu chứa protein được bảo quản trong điều kiện -80°C và có bổ sung chất bảo quản với nồng độ cuối như sau:
EDTA 10 mM, Cyteins 5 mM, Grycerol 15%, thể tích các thành phần được thể hiện trong Bảng 2.3.
- Sau đó, chia nhỏ mẫu cất giữ ở -80°C.
Bảng 2.3: Thành phần trong dịch protein khi bảo quản ở -80°C
Thành phần Thể tích Thể tích protein 25000 µl Cyteins 1 M 140 µl EDTA 0.5 M 560 µl Glycerol 100% Đã bổ sung bằng thẩm tách Tổng thể tích 25700 µl