- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.1.1. Lên men biểu hiện protein đột biến dung hợp
Sử dụng các thông số về điều kiện nuôi cấy và cảm ứng đã được khảo sát trước đó bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên để tiến hành nuôi cấy chủng B. subtilis tái tổ hợp và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu bằng IPTG trong hệ thống lên men GX-Fermentor 5L (BIOTRON Inc).
Tiến hành hoạt hóa giống 2 lần trước khi lên men, để tăng số lượng vi khuẩn ban đầu. Khi vi khuẩn trong bồn men đạt khoảng giữa pha tăng trưởng, tiến hành cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu bằng chất cảm ứng IPTG.
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) là phân tử có cấu trúc tương tự như lactose, nhưng không bị phân cắt bởi β-galactosidase. IPTG được dùng làm chất cảm ứng thay cho lactose để tăng hiệu suất cảm ứng biểu hiện của protein tái tổ hợp điều hòa bởi lac operator.
- Quy trình lên men như sau:
- Hoạt hóa giống sơ cấp trong 30 ml môi trường LB-Cm qua đêm ở 30°C.
- Chuyển dịch nuôi cấy sơ cấp vào 300 ml LB-Cm, nuôi cấy lắc ở 30°C để hoạt hóa giống thứ cấp. khi OD600nm đạt từ 1 – 2, chuyển toàn bộ dịch nuôi cấy thứ cấp vào bồn lên men chứ 4 lít môi trường LB-Cm.
- Quá trình lên men được duy trì ở nhiệt độ 30°C, pH 7.0. Thực hiện đo OD600nm theo giờ để xây dựng đường cong tăng trưởng.
- Tiến hành cảm ứng biểu hiện protein dung hợp bằng IPTG với nồng độ cuối là 0.5 mM khi tế bào vào giữa pha tăng trưởng.
- Thu mẫu tế bào khi vào pha cân bằng và ly tâm dịch 6000 v/p ở 4°C, trong 30 phút để thu nhận sinh khối.
- Cân khối lượng sinh khối thu được và bảo quản ở -80°C.