- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.2. Tinh chế protein LLOE247M/D320K 1 Thu nhận protein LLO E247M/D320K
Nguyên tắc
Sử dụng phương pháp sắc kí ái lực để tiến hành thu nhận protein đột biến. Phương pháp sác kí ái lực dựa trên sự hấp thu thuận nghịch giữa các phân tử sinh học với các ligand của chúng bằng các tương tác chuyên biệt. Protein dung hợp chứa đuôi 6xHis, đuôi được sử dụng phổ biến cho tinh chế các protein tái tổ hợp. Histidine là một acid amin có ái lực cao với ion Ni2+, dựa vào đặc tính này, protein LLO được thu nhận sử dụng cột histrap HP 5 ml (GE healthcare) với ligand là Ni2+.
Cột histrap HP (High Performance) là dụng cụ tinh chế dựa trên ái lực của phân tử mục tiêu với các ligand được gắn trên cột. Bên trong cột có chứa các hạt gel Sepharose, Ni2+ được nạp đầy vào cột trước khi tiến hành tinh chế. Các Ni2+ bám với Sepharose trên cột, mà nó chính là chỗ trung gian cho Histidine gắn vào kéo theo protein mục tiêu bị vướng lại và tiến hành tinh chế dễ dàng.
Hầu hết các phương pháp tinh chế dựa vào sắc kí ái lực đều trải qua 3 bước cơ bản: cân bằng cột, nạp mẫu và rửa, dung ly protein ra khỏi cột. Trước khi nạp mẫu, cột được cân bằng tạo pha ổn định để bắt đầu tinh chế. Mẫu protein được nạp vào cột và tiến hành rửa, ở bước này protein mục tiêu sẽ bị giữ lại trên cột nhờ liên kết chuyên biệt với Ni2+ trong cột. Một số protein bám không đặc hiệu và một số bị vướng lại sẽ bị đẩy ra ngoài nhờ bước rửa với EBW, góp phần cho mẫu protein tinh sạch hơn. Quá trình dung ly sử dụng dung dịch chứa chất cạnh tranh vị trí bám với protein, đẩy protein mục tiêu ra khỏi cột, nồng độ chất cạnh tranh sử dụng tăng dần để kiểm soát quá trình dung ly.
Imidazol là chất có ai lực cao với Ni2+, được sử dụng trong dung dịch dung ly để tinh chế protein. Khi vào cột, Imidazol sẽ giành lấy các ví trí bám vào Ni2+ của đuôi his
trên protein, đẩy protein ra khỏi cột. Nồng độ Imidazol được sử dụng tăng dần để đẩy dần protein ra ngoài, thuận lợi kiểm soát các phân đoạn còn hay đã đẩy hết lượng protein ra rồi. Mặc khác, nồng độ Imidazol quá cao cũng gây khó khăn cho quá trình thẩm tách về sau. Thông thường, nồng độ Imidazol cao nhất để đẩy sạch các dạng protein chứa đuôi his là khoảng 500 mM. Ngoài ra, Imidazol còn được thêm vào dung dịch EBW với nồng độ thấp để giảm sự bám không đặc hiệu của các protein tạp trong tế bào. Tuy nhiên, tùy vào độ bám đặc hiệu của protein mục tiêu lên cột mà điều chỉnh nồng độ Imidazol trong EBW cho hợp lí. Vì ở nồng độ Imidazol cao sẽ làm giảm sự bám của protein chứa đuôi His lên cột dẫn đến giảm hiệu suất tinh chế.
Quy trình thực hiện
• Chuẩn bị mẫu protein qua cột:
- Sinh khối tế bào sau khi lên men được huyền phù với dung dịch EBW theo tỉ lệ 1:4.
- Bổ sung lysozyme sao cho nồng độ cuối là 1 mg/ml, ủ nhiệt độ 37°C trong 20 phút.
- Bổ sung PMSF và DNaseI với nồng độ cuối lần lượt là 1mM và 1 mg/ml.
- Tiến hành phá tế bào bằng sóng siêu âm trong điều kiện lạnh, chương trình phá tế bào với biên độ sóng 70, thực hiện 30 chu kì, mỗi chu kì 30 giây phá 30 giây nghỉ.
- Ly tâm mẫu 12500 v/p trong 20 phút ở 4°C loại bỏ cặn thu nhận phần sinh khối chứa protein của tế bào vi khuẩn.
Bảng thành phần bổ sung vào mẫu protein trong quá trình chuẩn bị mẫu
Thành phần bổ sung Thể tích
Lysozyme 50 mg/ml 500 µl
PMSF 0.5M 60 µl
DNaseI 50 mg/ml 300 µl
• Tinh chế protein mục tiêu:
- Cân bằng cột Histrap HP với 50 ml dung dịch EBW lạnh. - Tiến hành lọc dịch nổi thu được qua màng lọc 2 µm.
- Dịch thu được cho chảy qua cột. - Cho 50 ml EBW chảy qua cột để rửa.
- Sử dụng các dung dịch dung ly có nồng độ Imidazol tăng dần từ 40, 80, 120, 160, 250 mM để thu từng phân đoạn protein, mỗi phân đoạn thu 7ml vào 7 eppendorf riêng biệt.
• Kiểm tra kết quả qua cột của protein bằng phương pháp SDS-PAGE:
- Mỗi bước, thu 20 µl dịch trước qua cột, sau qua cột, dịch rửa cột và các phân đoạn dung ly vào các epp.
- Thêm 5 µl dung dịch nạp mẫu (sample buffer) 5X, đảo đều. - Xử lý nhiệt ở 95°C trong 5 phút. Ly tâm 13000 v/p trong 5 phút.
- Nạp 5 µl dịch nổi mẫu và 2 µl thang protein, tiến hành chạy SDS-PAGE kiểm tra kết quả.