- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.1.2. Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp trước và sau cảm ứng IPTG bằng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE)
bằng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE)
Nguyên tắc
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) la kĩ thuật điện di trên gel polyacrylasmide. Sự di chuyển của protein trên gel trong một điện trường ổn định là tùy thuộc vào khối lượng phân tử và kích thước của protein.
Gel polyacrylamide là sản phẩm trùng ngưng của các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình trùng ngưng được xúc tác bởi hệ thống APS (ammonium pesulfate) – N,N,N’,N’-tetramethylenediamine (TEMED). Sau trùng ngưng, sản phẩm tạo thành là một mạng lưới gel cho phép các protein có kích thước khác nhau di chuyển xuyên qua lỗ lưới với vận tốc khác nhau. Trong SDS-PAGE, sử dụng chất biến tính mạnh SDS, nó sẽ bám lên phần kị nước của protein làm âm tính hóa protein và ngăn cản các liên kết hydro cho quá trình hồi tính. DTT (dithiothreitol) được thêm vào cộng với quá trình biến tính ở nhiệt độ 100°C để loại bỏ các cầu nối disulfide trong phân tử protein. Lúc này, tất cả các protein sẽ bị chuyển về cấc trúc bậc một và tích điện âm. Do vậy, quá trình di chuyển của protein trong điện trường là hoàn toàn phụ thuộc vào kích thước protein: các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn qua các lỗ gel có kích thước đồng nhất.
Để các protein trong mẫu chạy điện di có cùng vách xuất phát và tạo ra sự phân tách tốt, phương pháp này sử dụng gel phân thành 2 lớp kế tiếp nhau: lớp gel gom phía trên và lớp gel phân tách phía dưới. Lớp gel gom giúp đưa các phân tử protein về cùng một vị trí xuất phát trên một băng mỏng, lớp gel phân tách có nồng độ gel cao hơn,
nhằm phân tách các protein có kích thước khác nhau thành các vạch khác nhau trên gel.
Quy trình kiểm tra sự biểu hiện protein dung hợp bằng SDS-PAGE
• Chuẩn bị mẫu để chạy SDS-PAGE
- Đo OD600nm dịch lên men trước tời điểm cảm ứng và mỗi 1 giờ sau cảm ứng. - Tiến hành thu mẫu sau mỗi lần đo dựa vào giá trị OD đo được, sao cho các lần
đo thu cùng một lượng tế bào quy về OD600nm = 1.2, riêng lần đo cuối thu OD600nm quy về 1.2 và thu thêm mẫu quy về OD600nm = 6 để chạy điện di kiểm tra tính tan của protein.
- Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu sinh khối.
- Huyền phù đều sinh khối quy về OD600nm = 1.2 với 100 µl lysis buffer. Tương tự cho một chứng âm mang phasmid pHT01.
- Với mẫu tế bào quy về OD600nm = 6, huyền phù với 100 µl lysis buffer, sonicate với biên độ 70, 10 chu kì, mỗi chu kì 15 giấy bắn 15 giây nghỉ (làm 2 mẫu như nhau). Làm tương tự cho một chứng âm mang plasmid pHT01. Sau đó 1 mẫu ly tâm 13000 v/p trong 5 phút, loại bỏ cặn. Thu dịch nổi và tiếp tục ly tâm 13000 v/p trong 5 phút, thu dịch nổi để làm mẫu tan. Cặn sau ly tâm bổ sung 100 µl lysis buffer, vortex đều để làm mẫu tủa. Mẫu còn lại chính là mẫu protein tổng. - Bổ sung thêm 25 µl sample buffer 5X vào mỗi mẫu, đảo đều.
- Sốc nhiệt ở 95°C trong 5 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 5 phút.
• Chạy SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein
- Nạp 5 µl dịch nổi sau ly tâm và 2 µl thang protein vào các giếng trên gel. - Chạy điện di với cường độ 300V, 25 mA.
- Sau khi mẫu chạy xong, tách gel ra khỏi bồn và kính đổ gel, loại bỏ lớp gel gom.
- Nhuộm gel với dung dịch nhuộm, đun vừa sôi và ngâm trong 1 phút.
- Tiến hành giải nhuộm với dung dịch giải nhuộm protein và nước cho tới khi nhìn rõ thang và các vạch protein.
2.2.2. Tinh chế protein LLOE247M/D320K2.2.2.1. Thu nhận protein LLOE247M/D320K