- DTT 1M EDTA 500 mM
2.2.2.2. Cắt loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein LLOE247M/D320K bằng TEV protease
Nguyên tắc
Nhờ được dung hợp với đuôi LysSN-6xHix-TEVsite mà protein mục tiêu được giữ lại trên cột, sản phẩm protein sau dung ly vẫn còn mang đuôi dung hợp này. Để thu nhận protein tái tổ hợp, cần tiến hành cắt bỏ đuôi dung hợp ra khỏi protein. Đuôi tinh chế được thiết kế chứa vị trí TEV nằm giữa đuôi His và LLOE247M/D320K, vị trí nhận biết của emzyme cắt TEV protease, thuận lợi để cắt bỏ đuôi dung hợp ngay tại vị trí này.
TEV protease là một enzyme cắt có nguồn gốc từ Tobacco Etch Virus. TEV protease cắt tại vị trí Gln và Gly trong vùng nhận diện chuyên biệt Glu-Asn-Leu-Tyr- Phe-Gln-Gly. Nhờ khả năng nhận diện chuyên biệt cao và tốc độ hoạt động nhanh nên TEV protease thường được sử dụng để cắt loại các đuôi dung hợp của protein tái tổ hợp. TEV protease được thiết kế đuôi 6xHis ở đầu N, đoạn protein bị cắt bỏ cũng chứa đuôi 6-His, vì vậy sau khi qua cột cả hai đều bám lại trên Ni2+, mẫu protein được tinh sạch.
Trước khi tiến hành phản ứng cắt, mẫu chứa protein cần được loại bỏ một số thành phần như: glycerol, Imidazol, NaCl, tránh ảnh hưởng tới phản ứng cắt loại bỏ
đuôi dung hợp. Để loại bỏ các chất này, thẩm tích là phương pháp hữu hiệu. Thẩm tích là phương pháp sử dụng màng thẩm tích, chỉ cho phép các ion hay các phân tử có kích thước nhỏ qua màng. Nhờ đó, giảm nồng độ các chất không mong muốn chứa trong bên trong màng. Tuy nhiên, phân tử protein mục tiêu với kích thước lớn thì vẫn được giữ lại. Tùy vào kích thước lỗ trên mỗi màng mà sẽ giữ lại các protein có kích thước khác nhau.
Quy trình thực hiện
• Quy trình trao đổi dung dịch và thực hiện phản ứng cắt:
- Sau khi kiểm tra bằng chạy SDS-PGAE, các phân đoạn chứ protein mục tiêu được trộn chung lại với nhau.
- Chuyển toàn bộ dịch protein vào cột thẩm tách.
- Ngâm cột thẩm tách trong dung dịch lưu trữ PIPES 6.0 có bổ sung 5% glycerol 30 phút, thực hiện 3 lần, mỗi lần thay dung dịch lưu trữ mới để giảm nồng độ các chất ảnh hưởng tới phản ứng cắt.
- Sau khi hoàn thành quá trình thẩm tách, bổ sung các thành phần EDTA và DTT với nồng độ cuối là 0.5 mM EDTA và 1mM DTT hỗ trợ phản ứng cắt.
- Bổ sung emzyme cắt TEV protease theo tỉ lệ 1:30 để cắt đuôi dung hợp. Phản ứng cắt được thực hiện trong 3 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Thành phần phản ứng cắt được thể hiện trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt loại bỏ đuôi dung hợp khỏi protein mục tiêu bằng emzyme cắt TEV protease
Thành phần phản ứng cắt Thể tích Protein mục tiêu (4.5 mg/ml) EDTA 0.5 M DTT 1 M TEV (10 mg/ml) 28000 µl 28 µl 28 µl 420 µl Tổng thể tích 28476 µl