- Tác dụng kháng khuẩn: nƣớc sắc hoàng kỳ 100% có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn lỵ Shigella, tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn
Đo thể tích bàn chân gây viêm
28
2.3.3.3. Thử tác dụng giảm đau
Sử dụng phƣơng pháp mâm nóng cải tiến [23] trên chuột cống trắng. Chuột cống trắng đƣợc nuôi ổn định ở điều kiện phòng thí nghiệm, chia ngẫu nhiên thành các lô:
Lô chứng: uống nƣớc muối sinh lý 1ml/100g chuột.
Lô indomethacin: uống indomethacin liều10mg/kg chuột. Lô TA 1: uống cốm Toạ An 1,25g/kg chuột.
Lô TA 2: uống cốm Toạ An 2,5g/kg chuột
Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại hai thời điểm: trƣớc khi cho chuột uống thuốc thử và sau khi cho chuột uống thuốc thử 5 ngày.
- Xác định ngƣỡng đau (thời gian phản ứng đau) trƣớc khi cho uống chế phẩm nghiên cứu: Đặt chuột lên mâm nóng, luôn duy trì ở nhiệt độ 56oC bằng hệ thống ổn nhiệt. Tính thời gian từ lúc đặt chuột vào mâm nóng đến khi chuột liếm chân sau. Loại bỏ những chuột phản ứng trƣớc 8 giây và sau 60 giây
- Xác định ngƣỡng đau sau uống chế phẩm thử: Sau khi xác định đƣợc ngƣỡng đau bình thƣờng chia chuột ngẫu nhiên vào các lô, cho uống nƣớc muối sinh lý, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu vào một giờ nhất định trong ngày với cùng thể tích 1 ml/100g chuột liên tục trong 5 ngày. Ngày thứ năm sau khi cho chuột uống nƣớc muối sinh lý, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu 30 phút, tiêm tác nhân gây đau cho chuột là carrageenan 1% trong nƣớc muối sinh lý với liều 0,05ml vào mỗi gan bàn chân sau của từng chuột. Xác định thời gian phản ứng đau của chuột tại thời điểm 150 phút sau khi tiêm tác nhân gây đau [7].
- Chỉ tiêu theo dõi
+ Ngƣỡng đau (thời gian phản ứng đau): là thời gian từ khi thả chuột vào trong mâm nóng đến khi chuột có phản ứng liếm chân sau hoặc nhảy lên)
+ Độ chênh lệch ngƣỡng đau trƣớc và sau khi dùng thuốc đƣợc tính theo công thức (8)
29
ΔT (%)= (8) Trong đó:
ΔT: Độ chênh lệch ngƣỡng đau trƣớc và sau khi dùng các chế phẩm thử.
To: Ngƣỡng đau trƣớc khi dùng chế phẩm thử.
Tt: Ngƣỡng đau sau dùng chế phẩm thử tại thời điểm 150 phút sau khi tiêm chất gây đau.
+ Phần trăm ức chế đau của lô thử so với lô chứng đƣợc tính theo công thức (9): I (%) = (ΔTc - ΔTt)/ ΔTc x100 (9)
Trong đó:
I (%): phần trăm ức chế phản ứng đau.
ΔTc: Độ chênh lệch ngƣỡng đau trƣớc và sau khi dùng chế phẩm thử trung bình lô chứng
ΔTt: Độ chênh lệch ngƣỡng đau trƣớc và sau khi dùng chế phẩm thử trung bình lô thử.
2.3.3.4.Thửđộc tính cấp [23], [60]
- Thí nghiệm tiến hành trên chuột nhắt trắng giống cái, nuôi ổn định 3 ngày. Chia chuột thành từng lô, mỗi lô 10 con cho uống Toạ An mức liều tăng dần đến liều tối đa chuột có thể dung nạp đƣợc bằng đƣờng uống với thể tích hằng định mỗi lần 0,2ml/10g chuột, ngày uống 2 lần, mỗi lần cách nhau 2 giờ.
- Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc. Những chuột chết đƣợc mổ để quan sát. Tính LD50(nếu có) theo phƣơng pháp Litchfield- Wilcoxon.
2.3.3.5. Thử độc tính bán trƣờng diễn [23], [60]
Súc vật: chuột cống trắng cả hai giống.
- Bố trí thí nghiệm
Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành 3 lô:
30
+ Lô TA 1: uống chế phẩm Tọa An với liều 1,25g/kg. + Lô TA 2: uống chế phẩm Tọa An với liều 3,75g/kg.
Chuột thí nghiệm đƣợc cho uống chế phẩm thử hoặc nƣớc hàng ngày vào 9 giờ sáng, liên tục trong 28 ngày (1ml/100g chuột). Trong suốt quá trình thử nghiệm, theo dõi tình trạng chung của chuột, hàng tuần cân để theo dõi trọng lƣợng cơ thể đồng thời điều chỉnh lƣợng thuốc uống. Tại thời điểm kết thúc (sau 28 ngày uống thuốc), lấy máu mắt của từng chuột cho vào hai loại ống nghiệm riêng: ống có chứa chất chống đông để làm các xét nghiệm huyết học và ống không chứa chất chống đông, ly tâm lấy huyết thanh để làm các xét nghiệm hóa sinh. Mổ toàn bộ chuột để quan sát đại thể các cơ quan, lấy ngẫu nhiên 3 chuột trong mỗi lô để làm tiêu bản vi thể gan và thận.
Qui trình xác định độc tính bán trƣờng diễn đƣợc mô tả ở hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình xác định độc tính bán trƣờng diễn 28 ngày
- Thông số đánh giá
+ Tình trạng toàn thân: hàng ngày theo dõi các biểu hiện của của động vật thực nghiệm (tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch mũi, miệng, hô hấp, phân, nƣớc tiểu…), hoạt động tự nhiên, tƣ thế, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nƣớc uống. Hàng tuần cân động vật thực nghiệm để theo dõi sự thay đổi khối lƣợng cơ thể đồng thời điều chỉnh lƣợng thuốc uống.
0 28
Uống nƣớc/thuốc hàng ngày Thích nghi
Theo dõi hàng ngày Cân hàng tuần
Cân, lấy máu xét nghiệm, tim, gan, thận, lách
Ngày -5
31
+ Các thông số huyết học: số lƣợng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lƣợng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, số lƣợng tiểu cầu, số lƣợng bạch cầu và tỷ lệ % tế bào lympho.
+ Các thông số hóa sinh: hoạt độ transaminase huyết thanh AST, ALT, glucose, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh.
+ Đại thể cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách. Cân ngay khối lƣợng các cơ quan và tính tỷ lệ so với khối lƣợng toàn bộ cơ thể.
+ Mô bệnh học: sau khi giết động vật thực nghiệm, các mẫu gan và thận đƣợc cố định bằng dung dịch Carnoy, vùi trong parafin, cắt các lát mỏng 5 – 7 µm, nhuộm hematoxylin – eosin và quan sát dƣới kính hiển vi quang học để đánh giá cấu trúc hình thái vi thể gan, thận. Tiêu bản đƣợc thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, trƣờng Đại học Y Hà Nội. Kết quả đƣợc đánh giá bởi PGS.TS. Lê Trung Thọ – Bộ môn Giải phẫu bệnh -Trƣờng Đại học Y Hà Nội đọc tiêu bản.
2.3.3.6.Xử lý số liệu
Các số liệu thử nghiệm dƣợc lý ( 2.3.3.1, 2.3.3.2, 2.3.3.3, 2.3.3.4, 2.3.3.5)
đƣợc biểu diễn dƣới dạng M ( M: là giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So
sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Dunnett test để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng. Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0. Sự khác biệt giữa các lô thử có ý nghĩa thống kê khi p < 0.05.
32
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thẩm định dƣợc liệu 3.1. Thẩm định dƣợc liệu
3.1.1. Diếp cá