Qua tham khảo tài liệu [14], [32] và kết quả khảo sát ở mục 3.2, tiến hành bào chế các công thức có các thành phần như trong bảng 3.4. Trong đó, F1 được bào chế theo phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi, sử dụng dung môi DCM; F2 được bào chế theo phương pháp nhũ hóa kép kết hợp khuếch tán dung môi, sử dụng dung môi ethyl acetat. Cả 2 công thức đều sử dụng lipid và phospholipid là tá dược tạo cốt lipid cho hệ SLNs. Thời gian siêu âm cho giai đoạn nhũ hóa lần 1 và lần 2 được xác định dựa trên tham khảo trong tài liệu [11], [32] kết hợp với kết quả bào chế sơ bộ trước đó. Kết quả được trình bày ở hình 3.5.
Bảng 3. 4 Công thức khảo sát cho SLNs sử dụng 2 phương pháp bào chế
Thành phần F1 F2
Pha nước nội
Mafenid acetat (g) 0,2 0,2
Dung dịch pha pha loãng (ml) 1 1
Pha dầu
GMS (g) 0,4 0,4
Phospho lipid (g) 0,1 0,1
DCM (ml) 5
Ethyl acetat (ml) 5
Pha nước ngoại Nồng độ Cremophor RH40
2% 2%
Nước cất (ml) 30 15
Pha pha loãng
Cremophor RH40 (g) 0,2%
Nước cất (ml) 35
Thời gian siêu âm
Giai đoạn 1 (phút) 3 1
Giai đoạn 2 (phút) 1 3
Nhận xét: Công thức F1 được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép bốc hơi dung môi cho thể chất lỏng, đặc, màu trắng đục như sữa; sau khi bốc hơi dung
môi lipid bị bám nhiều trên thành cốc. Pha loãng hệ bằng nước cất thấy các tiểu phân nhìn thấy bằng mắt thường và bị tụ trên bề mặt pha nước nhanh chóng. Quá trình bào chế công thức F1 khó khăn do lipid dễ bị đông lại, bám dính vào dụng cụ và thiết bị, ảnh hưởng đến sự đồng nhất về tỷ lệ các thành phần trong quá trình khảo sát. Tiến hành bào chế với 2 lipid còn lại được lựa chọn ở mục 3.3.2 là acid stearic và cetyl alcol theo công thức F1 cũng thu được kết quả tương tự. KTTP được xác định nằm trong khoảng micromet phù hợp với nhận định của António J. và cộng sự [5].
Hình 3. 5 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của phương pháp bào chế đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Công thức F2 được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép khuếch tán dung môi cho thể chất lỏng trong suốt, màu trắng đục. Quá trình bào chế thuận lợi do tiến hành ở nhiệt độ cao nên lipid tan hoàn trong dung môi hữu cơ, không bị bám dính dụng cụ và thiết bị. Tiểu phân thu được cũng có kích thước nhỏ hơn, nằm trong khoảng nanomet. Điều này có thể giải thích như sau: trong cùng một điều kiện siêu âm và khuấy từ (là các lực gây phân tán nhũ tương chính), kích thước giọt dầu thu được ban đầu (trước khi dung môi khuếc tán hoặc bay hơi) là tương tự nhau. Quá trình dung môi khuếch tán sang pha nước, kích thước tiểu phân thu được do 2 tác động: dưới tác dụng của lực khuấy từ và dòng dung môi khuếch tán chia nhỏ 1 giọt
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2000 4000 6000 8000 F1 F2 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
dầu to thành nhiều giọt nhỏ hơn (quá trình chia nhỏ tiểu phân), khi dung môi khuếch tán và bay hơi, tiểu phân co lại. Trong khi đó, với quá trình bốc hơi dung môi, giọt dầu chỉ bị giảm kích thước do dung môi bay hơi mất đi. Do vậy tiểu phân thu được bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi có kích thước nhỏ hơn tiểu phân thu được bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi.
Cả hai công thức trên đều cho PDI lớn, chứng tỏ kích thước tiểu phân phân bố không đồng đều, có thể do thành phần công thức lựa chọn chưa thích hợp và quy trình chưa tối ưu. Từ kết quả và những phân tích ở trên, phương pháp nhũ hóa kép khuếch tán dung môi được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3.3.2 Khảo sát loại lipid
Lipid là thành phần chính trong công thức SLNs để tạo ra cốt lipid cho tiểu phân nano lipid rắn. Các nghiên cứu cho thấy, lipid ảnh hưởng rất lớn tới KTTP, PDI và hiệu suất bao gói dược chất [31]. Dựa vào những nguyên liệu có sẵn trong phòng thí nghiệm và một số kết quả khảo sát tiền công thức ở mục 3.2, tiến hành bào chế các công thức F3, F4, F5, F6 như trong bảng 3.5. sử dụng 4 loại lipid là GMS, Precirol, Compritol và cetyl alcol, thu được kết quả ở hình 3.6.
Bảng 3. 5 Công thức khảo sát cho hệ SLNs sử dụng các loại lipid khác nhau
Thành phần F3 F4 F5 F6 Pha dầu GMS (g) 0,5 Compritol 0,5 Precirol 0,5 Cetyl alcol 0,5 Phospho lipid (g) 0,13 0,13 0,13 0,13 Ethyl acetat (ml) 5 5 5 5
(Các thành phần khác tương tự như công thức F2)
Công thức F6 sử dụng chất mang là cetyl alcol cho hệ bị gel hóa ngay sau khi bào chế. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng gel hóa như nhiệt độ cao, tiếp
xúc với ánh sáng [6]. Một nguyên nhân khác có thể là do phân tử chất diện hoạt không đủ để bao hết bề mặt kỵ nước của tiểu phân lipid rắn.
Các công thức còn lại cho kích thước tiểu phân giảm dần theo thứ tự:
SLNs GMS > SLNs Compritol > SLNs Precirol
Trong đó, công thức F3 sử dụng GMS làm chất mang có KTTP lớn nhất nằm ngoài khoảng nanomet và PDI cao, chứng tỏ kích thước tiểu phân phân bố không đồng đều và hệ không ổn định. Công thức F4 (Compritol) tiểu phân có kích thước nhỏ hơn, khoảng 500 nm nhưng PDI của hệ xấp xỉ 0,4 chứng tỏ hệ tiểu phân không có sự đồng đều về kích thước. Trong khi đó, công thức F5 sử dụng chất mang Precirol cho thể chất ổn định nhất với KTTP là 136,2 nm và PDI 0,173. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3. 6 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các loại lipid đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Kết quả trên tương đối phù hợp với nghiên cứu của Jenning V. và cộng sự khi so sánh về KTTP giữa các mẫu bào chế bằng GMS, tripalmitat và glyceryl behenat (Compritol). Điều này có thể do trạng thái kết tinh khác nhau của các lipid: GMS và glyceryl behenat có trạng thái kết tinh trật tự kém, phụ thuộc vào tỷ lệ monoglycerid trong công thức. Lượng monoglycerid là 0% với tripalmitat, 15% với glyceryl behenat và 50% với GMS [16].
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 500 1000 1500 2000 F3 F4 F5 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
Hiệu suất bao gói dược chất của 3 công thức trên không có sự chênh lệch lớn, tương ứng với F3, F4, F5 lần lượt là 12,21%, 12,69% và 11,45%. Điều này có thể giải thích do lipid không trực tiếp bao gói tinh thể dược chất như SLNs bào chế bằng phương pháp nhũ hóa đơn mà chỉ bao gói giọt nước hòa tan dược chất, chính vì vậy các đặc tính như độ dài mạch cacbon của lipid, nhiệt độ nóng chảy, trạng thái kết tinh.. cũng không ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất bao gói dược chất.
Từ kết quả trên, Precirol được lựa chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
3.3.3 Khảo sát nồng độ lipid trong hệ tiểu phân nano lipid rắn
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ lipid, tiến hành bào chế SLNs sử dụng hỗn hợp lipid gồm Precirol và phospholipid tỷ lệ 4:1 với các nồng độ lipid khác nhau là 1; 1,5; 2; 2,5% (w/v) tương ứng với công thức F7, F8, F9, F10, các thành phần khác tương tự như công thức F5. Kết quả được trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ lipid đến KTTP, PDI và EE của SLNs bào chế được
Nhận xét: Quan sát công thức F10, nhận thấy có hiện tượng tách pha sau khi bào chế (pha lipid bị tách ngay khỏi hệ và nổi lên trên bề mặt pha nước) chính vì vậy không tiến hành đánh giá KTTP, PDI và EE của F10. KTTP và EE% của các hệ bào chế theo công thức F7, F8, F9 cho kết quả tăng dần khi nồng độ lipid tăng dần. Có thể giải thích như sau: khi tăng nồng độ lipid, độ nhớt của pha dầu tăng nên cần
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 40 80 120 160 F7 F8 F9 PDI KTTP (nm ), EE (% ) KTTP EE PDI
năng lượng phân cắt lớn hơn để phân tán dung dịch dược chất vào pha dầu. Do vậy với cùng năng lượng siêu âm, tăng nồng độ lipid sẽ làm tăng KTTP.
Kết quả xác định hiệu suất bao gói dược chất cho thấy khi tăng nồng độ lipid, hiệu suất bao gói dược chất cũng tăng lên. Điều này có thể giải thích như sau: trong cấu trúc của SLN được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép, pha lipid rắn đóng vai trò như một hàng rào bảo vệ dung dịch dược chất bên trong khỏi tác động lý hóa bên ngoài gây tác động đến độ ổn định, đồng thời ngăn chặn sự khuếch tán dược chất ra pha ngoại. Khi tăng nồng độ lipid trong hệ, bề dày của hàng rào này cũng tăng lên, hiệu quả ngăn chặn sự khuếch tán dược chất cũng tốt hơn, do đó, khi tăng nồng độ lipid, hiệu suất bao gói dược chất của SLNs tăng lên.
Với hiệu suất bao gói dược chất cao nhất lên đến 18,4% và thể chất ổn định, KTTP là 147,8 nm, PDI là 0,226, nồng độ lipid 2% được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3.3.4 Khảo sát lựa chọn chất diện hoạt thân nước
Chất nhũ hóa là thành phần quan trọng trong công thức bào chế nhũ tương nói chung và SLNs nói riêng. Thông thường, để thu được nhũ tương kép ổn định phải sử dụng 2 loại chất diện hoạt thân dầu và thân nước. Trong khảo sát này, chất diện hoạt thân dầu được cố định là phospholipid với tỷ lệ lệ phospholipid : lipid là 1:4 dựa theo tài liệu [33]. Các chất diện hoạt thân nước được khảo sát là Cremophor RH40, Poloxamer F188, PVA và Tween 80. Theo tham khảo một số tài liệu, khi tăng nồng độ chất diện hoạt từ 0 – 5%, KTTP thay đổi không đáng kể. Do đó, nồng độ chất diện hoạt ở pha ngoại được cố định là 2% (w/v) và pha pha loãng là 0,2% (w/v) với chất diện hoạt tương ứng. Kết quả được thể hiện ở hình 3.8.
Bảng 3. 6 Các chất diện hoạt thân nước dùng để khảo sát công thức SLNs
Công thức F11 F12 F13 F14
Loại chất diện hoạt Cremophor RH40
Poloxamer
F188 Tween 80 PVA
Nồng độ % (w/v) 2 2 2 2
Hình 3. 8 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của loại chất diện hoạt thân nước đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Trong 4 chất diện hoạt thân nước đã khảo sát, Cremophor RH40 cho SLNs có thể chất tốt nhất với KTTP trung bình 131,7 nm và PDI 0,221. Trong khi đó, quan sát mẫu sử dụng PVA có các tiểu phân nhìn thấy bằng mắt thường, bị tụ lại và nổi lơ lửng trong pha nước (KTTP là 2753 nm, PDI là 0,866). Công thức F13 sử dụng Tween 80 làm chất diện hoạt trong pha ngoại cho giá trị PDI cao gần 1, chứng tỏ hệ rất đa phân tán mặc dù KTTP trung bình vẫn nằm trong khoảng nanomet; mẫu sau khi bào chế có các tiểu phân bị lắng xuống đáy cốc. Công thức F12 có KTTP trung bình khoảng 300 nm song PDI > 0,3. Do đó, chúng tôi không tiến hành định lượng để xác định hiệu suất bao gói thuốc mà lựa chọn Cremophor RH40 cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.5 Khảo sát tỷ lệ thể tích pha nước nội : pha dầu
Bào chế SLNs bằng phương pháp nhũ hóa kép cần đặc biệt chú ý đến tỷ lệ giữa các pha. Tỷ lệ pha ảnh hưởng đến độ ổn định của nhũ tương kép và trực tiếp ảnh hưởng đến thể chất của SLNs cũng như hiệu suất bao gói dược chất. Theo tham khảo nghiên cứu của Deepak S. và nghiên cứu của Herrmann J. [11], [15], chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ pha nước nội và pha dầu với các tỷ lệ như bảng 3.7, trong
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 1000 2000 3000 4000 F11 F12 F13 F14 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
đó thể tích pha dầu được giữ cố định là 5 ml và thay đổi thể tích pha nước nội để có được các tỷ lệ như mong muốn.
Bảng 3. 7 Các tỷ lệ pha nội:pha dầu dùng để khảo sát công thức SLNs
Công thức Tỷ lệ pha nước nội : pha dầu Thể tích cuối cùng vừa đủ (ml)
F15 1 : 10 50
F16 1 : 5 50
F17 2 : 5 50
Hình 3. 9 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng tỷ lệ pha nội : pha dầu đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Theo kết quả được trình bày ở hình 3.9, khi tăng tỷ lệ pha nước nội : pha dầu, KTTP có xu hướng tăng nhẹ từ 131,7 nm đến 214 nm; giá trị PDI giữa các công thức có sự khác biệt không nhiều và dao động quanh mức 0,2. Một giả thuyết cho sự thay đổi KTTP theo tỷ lệ pha nước nội : pha dầu được chúng tôi đặt ra như sau:
Gọi thể tích pha nước nội là V, số tiểu phân nước phân tán trong pha dầu là a, bán kính tiểu phân là r, tổng diện tích bề mặt tiểu phân là A. Một cách tương đối (giả sử tiểu phân có hình cầu) ta có các công thức sau:
V=𝑎43𝜋𝑟3 (1); A = 4πr2 (2) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 50 100 150 200 250 F15 F16 F17 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
Từ (1) và (2) có: A=3𝑉 𝑟
Giả sử để bao phủ được hết diện tích bề mặt A cần một lượng chất diện hoạt là m (g). Giữ cố định khối lượng m ở cả 3 công thức sẽ có diện tích bề mặt được bao phủ bởi chất diện hoạt là như nhau, vậy bán kính r hay nói cách khác là KTTP tỷ lệ thuận với thể tích V của pha nước nội. Như vậy, khi giảm thể tích pha nước nội, kích thước giọt nước nội sẽ giảm đi và gián tiếp làm giảm kích thước của giọt nhũ tương kép. Đây có thể là một trong những nguyên nhân dẫn đến xu hướng tăng KTTP khi tăng thể tích pha nước nội. Tuy nhiên sự thay đổi KTTP là không lớn, có thể tỷ lệ pha nước nội : pha dầu ảnh hưởng không nhiều đến KTTP và PDI của SLNs thu được, nhưng cũng có thể do quy mô của thí nghiệm tiến hành còn nhỏ nên thể tích pha nước nội giữa các công thức khác biệt không nhiều (0,5; 1; 2 ml).
Xu hướng thay đổi của EE theo tỷ lệ pha nước nội : pha dầu cũng chưa thấy rõ do kết quả định lượng cho hiệu suất thấp bất thường khó giải thích. Điều này phản ánh mối quan hệ phức tạp giữa các yếu tố như tỷ lệ pha, độ nhớt, độ ổn định của nhũ tương lần 1 và tỷ lệ của polyme trong pha dầu.
Để thuận tiện cho quá trình bào chế, tỷ lệ 1:5 được giữ lại để thực hiện khảo sát tiếp theo.
3.3.6 Khảo sát thời gian siêu âm
Trong quá trình bào chế, tổng năng lượng siêu âm và độ đồng đều của lực phân tán sẽ quyết định KTTP và PDI của hệ tương ứng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên KTTP và PDI của hệ.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm các giai đoạn lên KTTP, PDI và EE% của SLNs mafenid acetat. Kết quả được trình bày trong hình 3.10 và hình 3.11.
Bảng 3. 8 Các thời gian siêu âm sử dụng để khảo sát
Công thức Thời gian siêu âm giai đoạn 1 Thời gian siêu âm giai đoạn 2
F18 180 s 0 s
F19 180 s 45 s
F20 180 s 90 s
F21 120 s 45 s
F22 120 s 90 s
Khi cố định thời gian siêu âm giai đoạn 1 là 180 s và thay đổi thời gian siêu âm giai đoạn 2 từ 0, 45, 90 giây thì KTTP trung bình giảm từ 520,9 nm xuống còn 131,7 nm, PDI cũng giảm từ 0,727 đến 0,221. Kết quả này có thể do trong thời điểm ban đầu khi phối hợp nhũ tương nội W/O vào pha ngoại, nhũ tương chưa được chia nhỏ hết, trong hệ còn nhiều tiểu phân lớn và các tiểu phân này cần thêm năng lượng để tiếp tục phân chia. Khi tăng thời gian siêu âm giai đoạn 2 lên bằng một nửa thời gian siêu âm trong giai đoạn 1 thước dưới 200 nm và PDI dưới 0,3.
Hình 3. 10 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 150 300 450 600 F18 F19 F20 F21 F22 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
Hình 3. 11 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến EE của SLNs bào chế được