Phương pháp định lượng mafenid acetat trong chế phẩm

2.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn trong môi trường nước.

a. Điều kiện sắc ký:

Qua tham khảo tài liệu [26] kết hợp với quá trình khảo sát các điều kiện tách mafenid acetat bằng phương pháp HPLC với các thiết bị đã nêu ở mục 2.1, lựa chọn:

- Thông số máy sắc ký:

Siê u â m + khuấy từ

Siê u â m + khuấy từ

HỆ TIỂU PHÂN

NANOLIPID RẮN

PHA DẦU

(Lipid, phospholipid, dung mô i hữu cơ)

PHA NƯỚC 1

(Dung dịch dược chất )

NHŨ TƯƠNG W/O

PHA NƯỚC 2

(Dung dịch chất diê ̣n hôật được bẫô hồâ

dung môi )

NHŨ TƯƠNG W/O/W

HỆ DỊ THỂ

PHA PHA LOÃNG

Khuấy từ chô đến khi bây hơi hết dung mô i. (A) (B ) Nhổ từ từ Phối hợp nhanh Phối hợp nhanh

 Hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260.

 Cột sắc ký Zorbax Eclipse XBD C18 250 x 4,6 mm, hạt nhồi 5 µm. - Pha động: methanol : dung dịch đệm phosphat (pH 2,5) (90 : 10), dung dịch

đệm được lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm trong 15 phút. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

- Detector UV phát hiện ở bước sóng 267 nm. b. Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Cân chính xác khoảng 125,0 mg mafenid acetat hòa tan trong nước cất 2 lần vừa đủ 50 ml được dung dịch A. Từ dung dịch A pha loãng bằng nước cất 2 lần thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 100, 200, 300, 400, 500 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Sau đó tiến hành chạy sắc ký. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ mafenid acetat.

2.3.3.2. Xây dựng đường chuẩn trong môi trường methanol.

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn tương tự mục 2.3.3.1.b với dung môi pha loãng là methanol. Tiến hành chạy sắc ký với các điều kiện như đã trình bày trong mục 2.3.3.1.a. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ mafenid acetat.

2.3.4 Thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng HPLC trong môi trường nước

- Chuẩn bị mẫu:

Mẫu chuẩn: pha tương tự mẫu chuẩn trong phương pháp định lượng bằng HPLC ở mục 2.3.3.1.

Mẫu trắng tá dược: bào chế công thức SLNs theo mô tả ở mục 2.3.2.2 với các thành phần như bảng 2.2.

Bảng 2. 2 Công thức bào chế SLNs làm mẫu trắng tá dược

Pha nước nội Nước cất 1 ml

Pha dầu

Precirol 0,60 g

Phospholipid 0,15 g

Ethyl acetat 5 ml

Pha nước ngoại Dung dịch Cremophor RH40 2% (pha nước ngoại) 15 ml

Pha pha loãng Dung dịch Cremophor RH40 2% (pha pha loãng) 35 ml

Xử lý mẫu như mục 2.3.5.2.

 Mẫu thử: tiến hành như đối với mẫu trắng chứa tá dược nhưng pha nước nội được hòa khoảng 200 mg dược chất.

- Độ đặc hiệu: Xử lý mẫu theo quy trình đã được lựa chọn. Tiến hành sắc ký các mẫu: mẫu trắng tá dược, mẫu chuẩn, mẫu thử. Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn mafenid acetat.

- Độ đúng và độ lặp lại: Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu mafenid acetat có nồng độ tương ứng là 300, 400, 500 µg/ml. Xác định hàm lượng mafenid acetat có trong các mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 3 mẫu. Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm được và nồng độ chuẩn thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng 98-102%. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD%, RSD% không vượt quá 2%.