acetat trong môi trường nước
3.1.1 Xác định độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu theo phương pháp HPLC mô tả ở mục 2.3.4. Đáp ứng của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử được trình bày ở hình 3.1, 3.2 và 3.3.
Hình 3. 1 Sắc ký đồ mẫu trắng tá dược
Hình 3. 2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mafenid acetat
Dựa vào các sắc ký đồ thu được ở trên có thể thấy tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của mafenid acetat không thấy xuất hiện pic trên sắc ký đồ của mẫu trắng tá dược. Pic mafenid acetat của mẫu thử, mẫu chuẩn cân đối, rõ ràng và sắc nét. Như vậy có thể kết luận phương pháp HPLC có độ đặc hiệu tốt đối với dược chất mafenid acetat.
3.1.2 Độ tuyến tính
Tiến hành chạy sắc ký 5 dung dịch mafenid acetat có nồng độ lần lượt là 100, 200, 300, 400, 500 µg/ml trong nước. Xây dựng mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ mafenid trong môi trường nước. Kết quả được trình bày trong các bảng 3.1 và hình 3.4.
Bảng 3. 1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ mafenid acetat trong môi trường nước
Nồng độ (µg/ml) 101,7 203,4 305,0 406,7 508,4 Diện tích pic
(mAu.s) 423,7 852,7 1270,5 1706,4 2067,9
Hình 3. 4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ mafenid acetat trong môi trường nước
y = 4,07x + 21,61 R² = 0,9991 0 500 1000 1500 2000 2500 0.0 200.0 400.0 600.0 Diệ n tí ch pic (m Au.s)
Nhận xét: Kết quả cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ mafenid acetat và diện tích pic trong khoảng nồng độ 100 đến 500 µg/ml với hệ số tương quan R2 > 0,99.
3.1.3 Độ đúng
Tiến hành xác định độ đúng ở nồng độ 75, 100 và 125% nồng độ định lượng C0 trong phương pháp định lượng theo mục 2.3.3. Kết quả thu được trong bảng 3.2:
Bảng 3. 2 Độ đúng của phương pháp định lượng HPLC
STT 75% 100% 125% Clýthuyết Ctìmthấy Độ đúng (%) Clýthuyết Ctìmthấy Độ đúng (%) Clýthuyết Ctìmthấy Độ đúng (%) 1 312,00 312,33 100,11 416,00 419,85 100,93 520,00 520,86 100,16 2 312,00 314,17 100,70 416,00 416,12 100,03 520,00 521,69 100,33 3 312,00 313,73 100,56 416,00 418,28 100,55 520,00 515,50 99,13 4 310,56 310,69 100,04 414,08 416,31 100,54 517,60 517,29 99,94 5 310,56 312,50 100,63 414,08 413,86 99,95 517,60 518,52 100,18 6 310,56 311,91 100,44 414,08 417,49 100,82 517,60 516,24 99,74 7 300,72 303,88 101,05 400,96 402,33 100,34 501,20 509,01 101,56 8 300,72 302,45 100,58 400,96 403,78 100,70 501,20 508,79 101,52 9 300,72 301,42 100,23 400,96 404,52 100,89 501,20 504,49 100,56 TB 100,48 100,53 100,36 SD 0,32 0,36 0,79 RSD (%) 0,32 0,36 0,79
Nhận xét: Kết quả cho thấy, với tất cả các nồng độ, tỷ lệ tìm lại nằm trong khoảng 99,13 đến 101,56% và giá trị RSD < 2%. Độ đúng trung bình tổng là 100,45% (RSD = 0,52%). Như vậy, phương pháp định lượng HPLC có độ đúng tốt.
Kết luận: Phương pháp HPLC thích hợp để định lượng mafenid acetat trong hệ SLNs trong nghiên cứu khảo sát xây dựng thành phần công thức và đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất bao gói dược chất.
Tương tự như vậy, phương pháp HPLC thích hợp để định lượng dược chất trong môi trường methanol, kết quả mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ mafenid acetat và diện tích pic ở phụ lục 1.
3.2 Kết quả khảo sát độ tan của lipid trong một số dung môi hữu cơ
Bảng 3. 3 Khả năng tan trong dung môi hữu cơ của lipid ở nhiệt độ thường và nhiệt độ cao
Compritol Precirol GMS cetyl alcol a.stearic
Aceton
25oC Không tan Không tan Không tan Không tan Không tan
60oC Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh
DCM
25oC Không tan Không tan Tan* Tan* Tan*
60oC Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh
Ethyl acetat
25oC Không tan Không tan Không tan Tan Tan
60oC Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh Tan nhanh
Nhận xét kết quả:
- Dung môi aceton
Ở nhiệt độ phòng (25oC) cả 5 loại lipid khảo sát đều không tan trong dung môi aceton ngay cả khi được khuấy trộn ở tốc độ cao.
Khi tăng nhiệt độ của hỗn hợp lên 60oC, lipid tan hoàn toàn trong dung môi tạo thành dung dịch trong suốt, nhưng khi cách ly với nguồn nhiệt, các
lipid nhanh chóng bị đông trở lại. Thứ tự đông đặc của lipid như sau: Compritol > Precirol > GMS > acid stearic > cetyl alcol.
- Dung môi DCM
Ở nhiệt độ phòng, Compritol và Precirol không tan trong dung môi diclomethan ngay cả khi được khuấy trộn ở tốc độ cao. Trong khi đó cetyl alcol, GMS, acid stearic tan chậm trong diclomethan (khi không tác động lực) và tạo dung dịch trong suốt (khi sử dụng lực rung lắc trên máy Votex). Thời gian cần để hòa tan lipid trong dung môi tăng dần theo thứ tự: acid stearic tan nhanh nhất (chưa đến 1 phút) < cetyl alcol < GMS (khó tan nhất, thời gian lắc trên 2 phút).
Khi tăng nhiệt độ lên 60oC (cao hơn nhiệt độ bay hơi của DCM), các lipid tan dễ dàng. Tuy nhiên khi cách ly khỏi nguồn nhiệt, Compritol bị đông vón lại nhanh chóng. Precirol cho dung dịch đục, 3 dung dịch còn lại vẫn trong suốt.
- Dung môi ethyl acetat
Ở nhiệt độ phòng: các lipid trên không tan trong ethyl acetat, khi lắc ở tốc độ cao: cetyl alcol và acid stearic tan, tạo dung dịch trong suốt.
Nâng nhiệt độ lên 60oC, tất cả các lipid tan, tuy nhiên, sau khi cách ly nguồn nhiệt trong một thời gian ngắn đều có hiện tượng đông tụ trở lại: Compritol đông tụ gần như ngay khi lấy ống nghiệm ra khỏi bể điều nhiệt, tiếp đến là Precirol. GMS bị tủa lại chậm nhất, khoảng 2 phút sau khi lấy ra khỏi bể điều nhiệt.
Bàn luận kết quả:
Với bản chất đồng tan trong nước, aceton là dung môi thích hợp để bào chế SLNs bằng phương pháp thay đổi dung môi. Cụ thể trong phương pháp này, lipid được hòa tan trong dung môi hữu cơ (pha dầu) và được nhỏ từ từ vào dung dịch chất diện hoạt (pha nước). Cơ chế hình thành tiểu phân nano lipid là khi dung môi khuếch tán sang pha ngoại, trên bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha có các mầm tinh thể lipid được tạo thành; các mầm này tiếp tục lớn lên trong quá trình khuếch tán dung môi và tạo thành các tiểu phân lipid. Để duy trì được quá trình khuếch tán, lipid phải tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phối hợp 2 pha. Khi tiến hành ở nhiệt độ cao, tiểu phân lipid hình thành sẽ lập tức bị chảy lỏng, nếu làm lạnh ngay
mặc dù giữ được cấu trúc của tiểu phân SLN nhưng khả năng lipid đông vón trước khi dung môi kịp khuếch tán ra ngoài rất lớn, kết quả là không thu được hệ SLNs như mong muốn. Do đó, lipid dùng trong phương pháp này phải tan được trong dung môi hữu cơ sử dụng ở nhiệt độ thường. Thêm vào đó, mafenid acetat là dược chất tan trong nước rất dễ thoát ra ngoài pha nước theo quá trình khuếch tán dung môi dẫn tới không được bao gói trong tiểu phân lipid. Từ kết quả khảo sát trên, nhận thấy aceton không thích hợp để bào chế hệ SLNs với dược chất thân nước như mafenid.
Dung môi DCM không tan trong nước nên thích hợp để bào chế SLNs theo phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi. Phương pháp này cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (thường được duy trì nhiệt độ bằng bể nước đá) để hạn chế sự bay hơi dung môi trong quá trình bào chế. Đây là một yếu tố quan trọng trong quá trình bào chế, nếu không kiểm soát được yếu tố này, dung môi sẽ bốc hơi ngay trong quá trình nhũ hóa dẫn đến tiểu phân có kích thước lớn và phân bố không đều, xuất hiện tiểu phân bám lên thành dụng cụ và thiết bị siêu âm.
Dung môi ethyl acetat lại có đặc tính khác là tan một phần trong nước, thích hợp để bào chế hệ tiểu phân nano bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi. Ưu điểm của phương pháp này là dễ kiểm soát về mặt kích thước, dễ nâng quy mô và độ lặp lại giữa các lô mẻ cao. Mặt khác, quá trình bào chế có thể tiến hành ở nhiệt độ cao do đó phạm vi sử dụng các lipid rộng rãi hơn.
Qua khảo sát trên, DCM và ethyl acetat được lựa chọn để bào chế SLNs theo 2 phương pháp: nhũ hóa kép bốc hơi dung môi (1) và nhũ hóa kép khuếch tán dung môi (2), tương ứng. Trong đó: GMS, cetyl alcol và acid stearic là những lipid tan trong DCM ở nhiệt độ thường được lựa chọn để bào chế SLNs bằng phương pháp (1); GMS, Compritol, Precirol và cetyl alcol được lựa chọn để bào chế SLNs theo phương pháp (2).
3.3 Xây dựng quy trình bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn chứa dược chất mafenid acetat mafenid acetat
3.3.1 Khảo sát phương pháp bào chế
Qua tham khảo tài liệu [14], [32] và kết quả khảo sát ở mục 3.2, tiến hành bào chế các công thức có các thành phần như trong bảng 3.4. Trong đó, F1 được bào chế theo phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi, sử dụng dung môi DCM; F2 được bào chế theo phương pháp nhũ hóa kép kết hợp khuếch tán dung môi, sử dụng dung môi ethyl acetat. Cả 2 công thức đều sử dụng lipid và phospholipid là tá dược tạo cốt lipid cho hệ SLNs. Thời gian siêu âm cho giai đoạn nhũ hóa lần 1 và lần 2 được xác định dựa trên tham khảo trong tài liệu [11], [32] kết hợp với kết quả bào chế sơ bộ trước đó. Kết quả được trình bày ở hình 3.5.
Bảng 3. 4 Công thức khảo sát cho SLNs sử dụng 2 phương pháp bào chế
Thành phần F1 F2
Pha nước nội
Mafenid acetat (g) 0,2 0,2
Dung dịch pha pha loãng (ml) 1 1
Pha dầu
GMS (g) 0,4 0,4
Phospho lipid (g) 0,1 0,1
DCM (ml) 5
Ethyl acetat (ml) 5
Pha nước ngoại Nồng độ Cremophor RH40
2% 2%
Nước cất (ml) 30 15
Pha pha loãng
Cremophor RH40 (g) 0,2%
Nước cất (ml) 35
Thời gian siêu âm
Giai đoạn 1 (phút) 3 1
Giai đoạn 2 (phút) 1 3
Nhận xét: Công thức F1 được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép bốc hơi dung môi cho thể chất lỏng, đặc, màu trắng đục như sữa; sau khi bốc hơi dung
môi lipid bị bám nhiều trên thành cốc. Pha loãng hệ bằng nước cất thấy các tiểu phân nhìn thấy bằng mắt thường và bị tụ trên bề mặt pha nước nhanh chóng. Quá trình bào chế công thức F1 khó khăn do lipid dễ bị đông lại, bám dính vào dụng cụ và thiết bị, ảnh hưởng đến sự đồng nhất về tỷ lệ các thành phần trong quá trình khảo sát. Tiến hành bào chế với 2 lipid còn lại được lựa chọn ở mục 3.3.2 là acid stearic và cetyl alcol theo công thức F1 cũng thu được kết quả tương tự. KTTP được xác định nằm trong khoảng micromet phù hợp với nhận định của António J. và cộng sự [5].
Hình 3. 5 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của phương pháp bào chế đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Công thức F2 được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép khuếch tán dung môi cho thể chất lỏng trong suốt, màu trắng đục. Quá trình bào chế thuận lợi do tiến hành ở nhiệt độ cao nên lipid tan hoàn trong dung môi hữu cơ, không bị bám dính dụng cụ và thiết bị. Tiểu phân thu được cũng có kích thước nhỏ hơn, nằm trong khoảng nanomet. Điều này có thể giải thích như sau: trong cùng một điều kiện siêu âm và khuấy từ (là các lực gây phân tán nhũ tương chính), kích thước giọt dầu thu được ban đầu (trước khi dung môi khuếc tán hoặc bay hơi) là tương tự nhau. Quá trình dung môi khuếch tán sang pha nước, kích thước tiểu phân thu được do 2 tác động: dưới tác dụng của lực khuấy từ và dòng dung môi khuếch tán chia nhỏ 1 giọt
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2000 4000 6000 8000 F1 F2 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
dầu to thành nhiều giọt nhỏ hơn (quá trình chia nhỏ tiểu phân), khi dung môi khuếch tán và bay hơi, tiểu phân co lại. Trong khi đó, với quá trình bốc hơi dung môi, giọt dầu chỉ bị giảm kích thước do dung môi bay hơi mất đi. Do vậy tiểu phân thu được bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi có kích thước nhỏ hơn tiểu phân thu được bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi.
Cả hai công thức trên đều cho PDI lớn, chứng tỏ kích thước tiểu phân phân bố không đồng đều, có thể do thành phần công thức lựa chọn chưa thích hợp và quy trình chưa tối ưu. Từ kết quả và những phân tích ở trên, phương pháp nhũ hóa kép khuếch tán dung môi được lựa chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo.
3.3.2 Khảo sát loại lipid
Lipid là thành phần chính trong công thức SLNs để tạo ra cốt lipid cho tiểu phân nano lipid rắn. Các nghiên cứu cho thấy, lipid ảnh hưởng rất lớn tới KTTP, PDI và hiệu suất bao gói dược chất [31]. Dựa vào những nguyên liệu có sẵn trong phòng thí nghiệm và một số kết quả khảo sát tiền công thức ở mục 3.2, tiến hành bào chế các công thức F3, F4, F5, F6 như trong bảng 3.5. sử dụng 4 loại lipid là GMS, Precirol, Compritol và cetyl alcol, thu được kết quả ở hình 3.6.
Bảng 3. 5 Công thức khảo sát cho hệ SLNs sử dụng các loại lipid khác nhau
Thành phần F3 F4 F5 F6 Pha dầu GMS (g) 0,5 Compritol 0,5 Precirol 0,5 Cetyl alcol 0,5 Phospho lipid (g) 0,13 0,13 0,13 0,13 Ethyl acetat (ml) 5 5 5 5
(Các thành phần khác tương tự như công thức F2)
Công thức F6 sử dụng chất mang là cetyl alcol cho hệ bị gel hóa ngay sau khi bào chế. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng gel hóa như nhiệt độ cao, tiếp
xúc với ánh sáng [6]. Một nguyên nhân khác có thể là do phân tử chất diện hoạt không đủ để bao hết bề mặt kỵ nước của tiểu phân lipid rắn.
Các công thức còn lại cho kích thước tiểu phân giảm dần theo thứ tự:
SLNs GMS > SLNs Compritol > SLNs Precirol
Trong đó, công thức F3 sử dụng GMS làm chất mang có KTTP lớn nhất nằm ngoài khoảng nanomet và PDI cao, chứng tỏ kích thước tiểu phân phân bố không đồng đều và hệ không ổn định. Công thức F4 (Compritol) tiểu phân có kích thước nhỏ hơn, khoảng 500 nm nhưng PDI của hệ xấp xỉ 0,4 chứng tỏ hệ tiểu phân không có sự đồng đều về kích thước. Trong khi đó, công thức F5 sử dụng chất mang Precirol cho thể chất ổn định nhất với KTTP là 136,2 nm và PDI 0,173. Kết quả được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3. 6 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các loại lipid đến KTTP và PDI của SLNs bào chế được
Kết quả trên tương đối phù hợp với nghiên cứu của Jenning V. và cộng sự khi so sánh về KTTP giữa các mẫu bào chế bằng GMS, tripalmitat và glyceryl behenat (Compritol). Điều này có thể do trạng thái kết tinh khác nhau của các lipid: GMS và glyceryl behenat có trạng thái kết tinh trật tự kém, phụ thuộc vào tỷ lệ monoglycerid trong công thức. Lượng monoglycerid là 0% với tripalmitat, 15% với glyceryl behenat và 50% với GMS [16].
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 500 1000 1500 2000 F3 F4 F5 PDI KTTP (nm ) KTTP PDI
Hiệu suất bao gói dược chất của 3 công thức trên không có sự chênh lệch lớn, tương ứng với F3, F4, F5 lần lượt là 12,21%, 12,69% và 11,45%. Điều này có thể giải thích do lipid không trực tiếp bao gói tinh thể dược chất như SLNs bào chế bằng phương pháp nhũ hóa đơn mà chỉ bao gói giọt nước hòa tan dược chất, chính vì vậy các đặc tính như độ dài mạch cacbon của lipid, nhiệt độ nóng chảy, trạng thái kết tinh.. cũng không ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất bao gói dược chất.
Từ kết quả trên, Precirol được lựa chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
3.3.3 Khảo sát nồng độ lipid trong hệ tiểu phân nano lipid rắn
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ lipid, tiến hành bào chế SLNs sử dụng hỗn hợp lipid gồm Precirol và phospholipid tỷ lệ 4:1 với các nồng độ lipid khác nhau là 1; 1,5; 2; 2,5% (w/v) tương ứng với công thức F7, F8, F9, F10, các thành phần khác tương tự như công thức F5. Kết quả được trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ lipid đến KTTP, PDI và EE của SLNs bào chế được