- Tủ sấy (Trung Quốc) - Tủ nuôi cấy (Trung Quốc) - Tủ cấy vô trùng (Trung Quốc) - Máy lắc (Trung Quốc) - Cân điện tử (Trung Quốc)
29
- Máy khuấy từ (Trung Quốc) - Máy đo pH (Trung Quốc) - Kính hiển vi (Trung Quốc)
- Các dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, bình tam giác, bình
định mức, các loại ống đong, ống hút, pipet, micropipet (Trung Quốc). - Các loại que cấy, que trang
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: Từ tháng 12/2013 – 5/2014
3.3. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm.
- Nội dung 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm.
- Nội dung 3: Nghiên cứu kết hợp chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc kháng vi khuẩn Gram âm.
- Nội dung 4: Theo dõi theo thời gian khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm
Định nghĩa MIC (minimum inhibitory concentration): là nồng độ thấp nhất của một kháng sinh sẽức chế sự phát triển của vi sinh vật.
30
Vi khuẩn hoạt hóa 24h, đo OD, sau đó pha loãng huyền dịch vi khuẩn bằng nước muối sinh lý 0,85% theo phương pháp pha loãng liên tiếp đến khi mật độ vi khuẩn đạt 105 CFU/ml.
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn, 0,4ml nano bạc ở các nồng độ khác nhau 25ppm; 12,5ppm; 6,25ppm; … (kiểm chứng là nước deion) với 0,5ml môi trường MP trong ống nghiệm. Sau 24h nuôi cấy tiến hành nhỏ giọt hỗn hợp đối kháng lên môi trường MP kiểm tra vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
Thí nghiệm 2: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm
Các ống chứa 0,5ml dung dịch MP đã được chuẩn bị, hấp tiệt trùng ở 121°C. Vi khuẩn hoạt hóa 24h, đo OD, sau đó pha loãng huyền dịch vi khuẩn bằng MP theo phương pháp pha loãng liên tiếp đến khi mật độ vi khuẩn đạt 105 CFU/ml.
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn, 0,4ml Chitosan ở các nồng độ 1%; 0,75%; 0,5%; 0,375%; 0,25%; 0,125%; 0,075% (kiểm chứng là các dung dịch đệm acetate) với 0,5ml môi trường MP trong ống eppendoff. Nồng độ Chitosan sau khi phối trộn được tính lại lần lượt là 4000; 3000; 2000; 1500; 1000; 500; 250ppm. Sau 24h nuôi cấy tiến hành nhỏ giọt hỗn hợp đối kháng lên môi trường MP kiểm tra vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc
Phối trộn 0,2 ml Chitosan ở các nồng độ MIC, MIC/2 với 0,2 ml nano bạc ở
các nồng độ MIC, MIC/2 theo công thức như sau:
Bảng 3.1. Công thức phối trộn Chitosan và nano bạc
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4
Chitosan/nano
bạc (MIC/2) / (MIC/2) MIC/2 / MIC MIC / MIC/2 MIC / MIC Kết quả
31
Tiến hành trộn 0,1ml huyền dịch vi khuẩn, 0,4 ml hỗn hợp Chitosan và nano bạc theo các công thức ở trên (kiểm chứng là dung dịch đệm acetate) với 0,5ml môi trường MP trong ống eppendoff. Sau 24h nuôi cấy tiến hành nhỏ giọt hỗn hợp đối kháng kiểm tra vi sinh vật còn sống sót trong dịch trộn.
Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian
Chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc được bổ sung 0,4 ml vào 0,5ml môi trường MP cùng với 0,1ml huyền dịch vi khuẩn. Sau thời gian 0, 4, 8, 12, 16… giờ
kể từ thời điểm bắt đầu trộn, định lượng mật độ vi khuẩn Gram âm còn sống sót.
3.4.2. Phương pháp phân tích
3.4.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn
3.4.2.2. Phương pháp quan sát hình thái tế bào và xác định mật độ tế bào
a. Phương pháp quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Khuẩn lạc vi khuẩn sau khi làm tiêu bản được nhuộm tím tinh thể trong 60s sau đó nhuộm lugol trong 60s rồi tẩy bằng cồn trong 30s, rửa bằng nước cất, nhuộm bổ sung Fuchsin hoặc Safranin ở 30s, làm khô và soi tiêu bản dưới kính hiển vi để
quan sát hình thái tế bào. 0,1ml vi sinh vật hoạt
hóa 24h, định lượng mật độ vi sinh vật
0,4ml chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc, kiểm
chứng đệm acetate
ống chứa 0,5ml MP
Dịch A, nuôi 37°
C
Sau 24h, quan sát, pha loãng định lượng vi sinh
32
b. Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc - Nguyên tắc
+ Để xác định số lượng khuẩn lạc trong mẫu:
Cân 1g mẫu pha loãng 10-5 cấy trên môi trường sau một thời gian
đếm số khuẩn lạc số vi khuẩn.
* Cấy chính xác một thể tích mẫu hoặc dịch pha loãng vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch.
* Mỗi độ pha loãng chúng ta cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp petri. * Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp.
* Đếm tất cả số khuẩn lạc trên mỗi đĩa (30 ÷ 300 khuẩn lạc/1 đĩa). - Cách tính kết quả Công thức: Trong đó: ∑ C : Tổng số khuẩn lạc/các đĩa n1 : Sốđĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ nhất
n2 : Sốđĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ hai
v : Thể tích mẫu cấy/mỗi đĩa
f1 : Độ pha loãng thứ nhất
N : Nồng độ khuẩn lạc
3.4.3. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Sử dụng phương pháp bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng: Vi sinh vật được hoạt hóa trong môi trường MP, sau đó được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng, nuôi 24h, trong 37°C, giữ trong tủ lạnh để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ 2 tuần 1 lần.
∑ C
N = => đơn vị: khuẩnlạc/g (ml) hoặc CFU/g (ml) (n1 + 0,1n2).f1.v
33
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm Gram âm
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn có thể ức chế sự phát triển của 104 CFU/ml vi sinh vật so với kiểm chứng [4].
Để xác định được MIC của chế phẩm nano bạc đối với vi khuẩn Gram âm chúng tôi tiến hành theo phương pháp như mục 3.4.1 (Thí nghiệm 1). Nano bạc
được pha với dải nồng độ từ 25ppm đến 0,390625ppm trong đệm DI, đối chứng là
đệm DI. Kết quảđược thể hiện trên hình 4.1 và bảng 4.1:
Hình 4.1. Kết quả xác định MIC của chế phẩm nano bạc kháng vi khuẩn Gram âm
Từ hình ảnh trên (Hình 4.1), các kí hiệu C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, tương
ứng với các nồng độ nano bạc là 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,78125; 0,390625ppm, Đ tương ứng với đối chứng. Kết quả thống kê được theo bảng dưới đây:
Kết quả
(-)
Kết quả
34
Bảng 4.1. Kết quảảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến hiệu quả kháng khuẩn
Gram âm Vi khuẩn Nồng độ nano bạc (ppm) Hiệu quả kháng E.coli Hiệu quả kháng S.Typhimurium 25 - - 12,5 - - 6,25 - - 3,125 + - 1,5625 + + 0,78125 + + 0,390625 + + Đối chứng + + (-) Không có khuẩn lạc mọc (+) Có khuẩn lạc mọc
Qua kết quả tại bảng 4.1 cho thấy đối với vi khuẩn E.coli khả năng ức chế sự
phát triển của vi khuẩn thể hiện từ 25ppm đến 6,25ppm và từ nồng độ 3,125ppm
đến 0,390625ppm nano bạc không thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn E.coli còn
đối với vi khuẩn S.Typhimurium khả năng ức chế sự phát triển thể hiện từ
25ppm đến 3,125ppm và từ nồng độ 1,5625ppm đế 0,390625ppm nano bạc không thể hiện được khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn này. Trong phạm vi nghiên cứu này thì nồng độ ức chế tối thiểu hay MIC của nano bạc đối với vi khuẩn E.coli là 6,25ppm và nồng độ ức chế tối thiểu hay MIC của nano bạc đối với vi khuẩn S.Typhimurium là 3,125ppm.
4.2. Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Chitosan đối với vi khuẩn Gram âm Gram âm
Nồng độ ức chế tối thiểu MIC được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn có thể ức chế sự phát triển của 104 CFU/ml vi sinh vật so với kiểm chứng [4].
35
Để xác định được MIC của chế phẩm Chitosan chúng tôi tiến hành theo phương pháp như mục 3.4.1 (Thí nghiệm 2). Chitosan được pha với dải nồng độ từ
4000ppm đến 250ppm trong dung dịch đệm acetate, đối chứng là đệm acetate, kết quả kháng E.coli và S.Typhimurium được trình bày trong hình 4.2 và bảng 4.2:
Hình 4.2. Kết quả xác định MIC của chế phẩm Chitosan kháng vi khuẩn Gram âm
Từ hình ảnh trên (Hình 4.2), các kí hiệu C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, tương
ứng với các nồng độ Chitosan là 4000; 3000; 2000; 1500; 1000; 500; 250ppm, Đ
tương ứng với đối chứng. Kết quả thống kê được theo bảng dưới đây:
Bảng 4.2. Kết quảảnh hưởng của nồng độ Chitosan đến hiệu quả kháng khuẩn
Gram âm Vi khuẩn Nồng độ Chitosan (ppm) Hiệu quả kháng E.coli Hiệu quả kháng S.Typhimurium 4000 - - 3000 - - 2000 - - 1500 - - 1000 - - 500 - - 250 + + Đối chứng + + (-) Không có khuẩn lạc mọc (+) Có khuẩn lạc mọc Kết quả (-) Kết quả (+)
36
Từ kết quả bảng 4.2 cho ta thấy ở các nồng độ từ 4000ppm đến 500ppm đối với cả 2 loại vi khuẩn đều không có khuẩn lạc mọc còn ở nồng độ 250ppm và đối chứng vẫn có khuẩn lạc mọc. Trong phạm vi nghiên cứu này thì nồng độ ức chế tối thiểu hay MIC của chế phẩm Chitosan đối với vi khuẩn E.coli và S.Typhimurium là
500ppm.
4.3. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn Gram âm Gram âm
Sau khi tìm nồng độ tối thiểu hay MIC của từng vật liệu đối với từng loại vi khuẩn, chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phức hợp bằng cách trộn lại với nhau để xác định tỷ lệ phức hợp tốt nhất. Phương pháp trộn đã được trình bày trên phần 3.4.1 (Thí nghiệm 3)
4.3.1. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn
E.coli
Chúng tôi xin phép nhắc lại MIC của hai loại vật liệu đối với E.coli như sau: MIC của Chitosan: 500ppm
MIC của nano bạc: 6,25ppm
Quá trình làm thí nghiệm, nhóm đã thu được kết quả như hình 4.3:
Hình 4.3. Kết quả kháng vi khuẩn E.coli của công thức phối trộn Chitosan và nano bạc
Kết quả
(-) Kết quả
37
Từ hình ảnh trên (Hình 4.3) thống kê được kết quả theo bảng dưới đây: Bảng 4.3. Hiệu quả kháng vi khuẩn E.coli của công thức phối trộn Chitosan và
nano bạc Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Đệm Chitosan/nano bạc 250/3,125 250/6,25 500/3,125 500/6,25 acetate Hình 4.3 + - + - + Kí hiệu: (+): Có khuẩn lạc mọc (-): Không có khuẩn lạc mọc Theo bảng 4.3 ta có kết quả sau:
- Chitosan/nano bạc: 250/6,25 và 500/6,25: E.coli không xuất hiện - Chitosan/nano bạc: 250/3,125 và 500/3,125: Có E.coli xuất hiện
Trong các công thức đã bố trí thì tỷ lệ phối trộn MIC giữa 2 loại vật liệu được chọn là:
Chitosan: 250 ppm Nano bạc: 6,25 ppm
4.3.2. Lựa chọn công thức phối trộn Chitosan với nano bạc kháng lại vi khuẩn
S. Typhimurium
Chúng tôi xin phép nhắc lại MIC của hai loại vật liệu đối với S. Typhimurium
như sau:
MIC của Chitosan: 500ppm MIC của nano bạc: 3,125ppm
38
Hình 4.4. Kết quả kháng vi khuẩn S.Typhimurium của công thức phối trộn Chitosan và nano bạc
Bảng 4.4. Hiệu quả kháng vi khuẩn S.Typhimurium của công thức phối trộn Chitosan và nano bạc Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 Đệm Chitosan/nano bạc 250/1,5625 250/3,125 500/1,5625 500/3,125 acetate Hình 4.4 + - + - + Kí hiệu: (+): Có khuẩn lạc mọc (-): Không có khuẩn lạc mọc Như bảng 4.4 đã thể hiện kết quả sau:
- Chitosan/nano bạc: 250/3,125 và 500/3,125: S.Typhimurium không xuất hiện - Chitosan/nano bạc: 250/1,5625 và 500/1,5625: Có S.Typhimurium xuất hiện
Trong các công thức đã bố trí thì tỷ lệ phối trộn MIC giữa 2 loại vật liệu được chọn là: Chitosan: 250 ppm Nano bạc: 3,125 ppm Kết quả (-) Kết quả (+)
39
Nhận xét: E.coli không phát triển được ở nồng độ có MIC của nano Bạc là
6,25 ppm. S.Typhimurium không phát triển được ở nồng độ có MIC của nano Bạc là 3,125 ppm. Trong khi đó E.coli và S.Typhimurium phát triển được mặc dù ở
nồng độ có MIC của Chitosan là 500ppm. Qua đây ta thấy rằng, mức độ kháng
E.coli và S.Typhimurium phụ thuộc nhiều vào sự thay đổi nồng độ nano bạc hơn là sự thay đổi của nồng độ Chitosan, chứng tỏ ảnh hưởng của nano bạc mạnh hơn Chitosan trong phức hợp lên E.coli và S.Typhimurium.
Điều này do nguyên nhân như sau, Chitosan được hòa tan hình thành các dạng mạch phân tử polyme trong dung dịch, nó có thể tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp. Bạc là một kim loại chuyển tiếp, khi hình thành dạng nano các hạt ion bạc được giải phóng trong hỗn hợp, một phần bị Chitosan giữ lấy tạo thành phức chất, nên lượng Chitosan trong dung dịch đã giảm đi đáng kể so với nguyên trạng vì vậy nó không còn tác dụng chi phối mức độ kháng khuẩn trong hỗn hợp. Đối với bạc khi hình thành dạng nano số lượng ion trong một hạt nano lên hàng trăm nghìn, mặc dù có tham gia liên kết tạo phức chất nhưng số lượng còn lại vẫn có thể tác
động đến khả năng sinh trưởng của E.coli và S.Typhimurium.
4.4. Khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian nano bạc theo thời gian
4.4.1. Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian bạc theo thời gian
Để theo dõi khả năng kháng vi khuẩn E.coli của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp như
mục 3.4.1 (thí nghiệm 4) với nồng độ Chitosan – nano bạc 250/6,25 ppm, đối chứng là đệm acetate. Kết quảđược thể hiện ở hình 4.5 và bảng 4.5.
40
Khả năng kháng vi khuẩn E.coli của chế phẩm phối hợp chitosan - nano bạc theo thời gian
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian (h) M ậ t độ E .c o li l o g ( C F U /m l) 250/6,25ppm Đệm
Hình 4.5. Biểu đồ khả năng kháng E.coli của chế phẩm Chitosan – nano bạc theo thời gian
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.5 cho thấy tế bào E.coli tiếp tục sinh trưởng trong môi trường đối chứng là đệm acetate. Trong môi trường chứa chế phẩm Chitosan – nano bạc ở nồng độ 250/6,25 ppm, trong khoảng thời gian 4 giờ đầu
E.coli bị ức chế mạnh cụ thể là ở 0h nồng độ E.coli là 7,15 logCFU/ml đến 4h thì nồng độ E.coli chỉ còn 3,62 logCFU/ml. Sau khoảng thời gian 4h đầu thì khả năng
ức chế E.coli giảm dần, cho đến 16h thì chế phẩm Chitosan – nano bạc gần nhưđã
ức chế hoàn toàn sự phát triển của E.coli và từ 20h trở đi thì vi khuẩn E.coli đã bị
tiêu diệt hoàn toàn.
4.4.2. Khả năng kháng vi khuẩn S.Typhimurium của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian Chitosan – nano bạc theo thời gian
Để theo dõi khả năng kháng vi khuẩn S.Typhimurium của chế phẩm phối hợp Chitosan – nano bạc theo thời gian chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp như mục 3.4.1 (thí nghiệm 4) với nồng độ Chitosan – nano bạc 250/3,125 ppm, đối chứng là đệm acetate. Kết quảđược thể hiện ở hình 4.6 và bảng 4.6.
41
Khả năng kháng vi khuẩn S .Typhimurium của chế phẩm phối hợp chitosan - nano bạc theo thời gian
0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 Thời gian (h) M ậ t đ ộ S .T y p h im u ri u