- Lên men đường (Fructose, Lactose, Maltose, Glucose,
2.5.6. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng C perfringens phân lập được
perfringens phân lập được
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng C. perfringens được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm (National Committee of Clinical Laboratory Standards – NCCLS, 1999) (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh
Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đường kính mm)
Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Cefotaxime (30 µg) ≤ 24 ≥ 24 Ceftiofur (30 µg) ≤ 17 18 - 20 ≥ 21 Cephalothine (30 µg) ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 Ceftazidime (30 µg) ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 Enroflorxacin (5 µg) ≤ 16 17 - 19 ≥ 20 Gentamycin (10 µg) ≤ 12 13 - 17 ≥ 18 Kanamycin (30 µg) ≤ 13 14 - 17 ≥ 18 Lincomycin (15 µg) ≤ 10 11 - 13 ≥ 14 Ofloxacin (5 µg) ≤ 12 13 - 15 ≥ 16 Penecillin G (10 µg) ≤ 24 ≥ 24 Spectinomycin (100 µg) ≤ 14 15 - 17 ≥ 18 Tetramycin (30 µg) ≤ 14 15 - 18 ≥ 19 2.5.7. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể. Tiến hành làm tiêu bản vi thểđể xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình sau:
- Cốđịnh bệnh phẩm: Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, để sau 7 - 10 ngày là có thể sử dụng được.
- Rửa formol
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27
4 – 5 mm. Đem rửa trong nước chảy nhẹ 24h, để rửa formol. - Khử nước: Cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn
+ Cồn 900 I: 3 giờ + Cồn 900 II: 3 giờ + Cồn 1000 I: 4 giờ + Cồn 1000 II: 12 giờ - Khử cồn: Cho quả hệ thống 3 lọ Xylen + Xylen I: 4 giờ + Xylen II: 4 giờ + XylenIII: 12 giờ
- Khử Xylen - Tẩm parafin: cho qua hệ thống 3 cốc đựng parafin + Parafin I: 6 giờ (ở 560C)
+ Parafin II: 6 giờ (ở 560C) + Parafin III: 12 giờ (ở 560C)
Đúc Block: Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin - Cắt mảnh và dán mảnh
+ Cắt mảnh bằng máy Microtom với độ dàn mảnh cắt khoảng 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 480C. Sau
đó để tủấm ở 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thểđem đi nhuộm được. - Nhuộm tiêu bản: Các bước nhuộm như sau:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm 3 lọ Xylen Xylen I: 6 giờ
Xylen II: 6 giờ
Xylen III: 12 giờ
+ Khử Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn 1000 I: 15 phút
Cồn 1000 II: 15 phút Cồn 900 III: 15 phút + Nhuộm Hematoxilin (nhuộm nhân)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
Khi nhấc tiêu bản ra khỏi cồn 900 III, đem rửa qua nước cất rồi lau khô xung quanh tiêu bản, nhỏ Hematoxilin ngập tiêu bản. Để trong vòng 5 - 15 phút. Sau đó,
đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước chảy cho hết Hematoxilin thừa. Đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô đi. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản 5 – 10 phút tùy theo thực tế màu Eosin. Sau đó, rửa nước chảy cho hết Eosin thừa.
Tẩy nước: ta cho tiêu bản qua hệ thống: Cồn 900 I: 3 – 5 phút
Cồn 1000 II: 3 – 5 phút Cồn 1000 III: 3 – 5 phút
Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua hệ thống 3 Xylen, mỗi Xylen 10 phút sau đó cho vào Xylen đã làm nóng trong tủấm 370C trong vòng 2 phút.
- Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học.