B ảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C perfingens
2.5.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Vi khuẩn C. perfringens được tiến hành phân lập và giám định theo quy trình của NCCLS (1999).
Các bước nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn C. perfringens như sau: - Bước 1:
Lấy 1 g mẫu phân cần nghiên cứu cho vào lọ có nắp, có chứa sẵn 10ml môi trường nước thịt TGC (sau khi đun nóng ở 1000C/30 phút và làm nguội nhanh để tạo điều kiện yếm khí). Giữ ở nhiệt độ 750C/25 phút trong bể
nhiệt. Làm nguội nhanh dưới vòi nước lạnh, rồi tiến hành nuôi cấy ở tủ ấm 370C/24-48 giờ (mở hờ nắp lọ để khí gas sinh ra không làm nổ lọ).
- Bước 2:
Sau 24 - 48 giờ, tiến hành ria cấy lên môi trường CW (có bổ sung 4% lòng
đỏ trứng gà) và đưa vào nuôi ở tủ yếm khí ở 370C/24 - 48 giờ. Chọn khuẩn lạc
điển hình, có hình thái đặc trưng của vi khuẩn C. perfringens như: khuẩn lạc tròn, gọn, màu trắng, hơi vàng, có mặt vồng đặc trưng, vùng môi trường bao xung quanh khuẩn lạc mờ đục, có màu vàng, môi trường thạch chuyển từ màu da cam thành màu vàng tươi.
- Bước 3:
Chọn khuẩn lạc có các đặc điểm như trên, tiến hành kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu, xác định một sốđặc tính nuôi cấy trên các môi trường (Phản ứng CAMP test, Litmus milk, SIM) và các đặc tính lên men một số môi trường đường Arabinose, Fructose, Lactose, Maltose, Glucose, Xylose, Saccarose). Sau đó, tiến hành giữ giống trên môi trường Cooked Meat (370C/24 giờ). Với phương pháp này, chủng vi khuẩn sau
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25
khi cấy và được bảo quản ở 40C có thể duy trì được tới 50 năm. - Bước 4:
Các chủng vi khuẩn, sau khi được phân lập và thuần nhất sẽ được tiến hành xác định các loại độc tố cơ bản bằng phản ứng PCR, trên cơ sở đó sẽ xác
định typ của vi khuẩn.
Hình 2.1. Sơđồ quy trình phân lập và giám đinh vi khuẩn C. perfringens
Mẫu
Tiêm tĩnh mạch cho chuột bạch
Đếm số khuẩn lạc trên thạch máu yếm khí, thạch TSC
Môi trường TGC (10 ml), ủở
750C/25 phút
Lọc qua màng lọc Pha loãng 10x Nuôi cấy
Làm nguội nhanh dưới vòi nước Nuôi trong tủấm 370C/24- 48h Tiêm chuột bạch Thạch CW, có bổ sung 4% lòng đỏ trứng 370C/24-48h/yếm khí Khuẩn lạc màu trắng, hơi vàng, tròn, gọn, mặt vồng,
vùng môi trường bao xung quanh mờđục, màu vàng
Kiểm tra hình thái Đặc tính nuôi cấy Đặc tính sinh hóa