chiết từ vỏ quả quất cảnh
2.2.3.1. Thử độc tính theo đường uống, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết vỏ quả quất cảnh theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm [40].Chuột nuôi thí nghiệm cho ăn thức ăn chuẩn trong thời gian 6 tuần và tiến hành cho uống thử độc tinh theo liều tăng dần bắt đầu từ 8g ,10g,12,14, đến 16g/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của vỏ quả quất cảnh.
2.2.3.2 Phương pháp xây dựng mô hình chuột béo phì bằng thức ăn
Mô hình chuột béo phì thực nghiệm được xây dựng trên dòng chuột nhắt chủng Swiss bằng chế độ thức ăn giàu chất béo, cholesterol và cacbonhydrate theo bảng 2.1 [13], [37], [46].
Phương pháp:
Chuột nhắt chủng Swiss được chia làm 2 nhóm và chăm sóc với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau như sau:
+ Nhóm 1: Chuột ăn thức ăn chuẩn( nhóm đối chứng)
+ Nhóm 2: Chuột ăn thức ăn giàu chất béo/cholesterol/cacbohydrate
được phối trộn từ nguồn thức ăn có sẵn ở Việt Nam( Bảng 2.1)
Chuột được chăm sóc trong vòng 6 tuần, trọng lượng chuột theo dõi hàng tuần. Vào ngày cuối cùng của thời kỳ nuôi béo, lựa chọn từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, cho nhịn đói 12h sau đó lấy máu tổng thể phân tích một số chỉ số lipid( Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-C, lipase), hàm lượng glucose huyết.
2.2.3.3.Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozotocin(STZ) liều thấp
Mô hình chuột ĐTĐ typ 2 được xây dựng trên chuột béo phì kết hợp với tiêm STZ liều thấp qua tham khảo từ nhiều tác giả khác nhau [45], [51], [52], [56], [57].
Phương pháp:
Chuột nuụi với chế độ ăn giàu chất bộo sau 6 tuần ở trờn, Sau 12h cho nhịn đúi, tiến hành tiờm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg thể trọng) pha trong đệm citrate 0,01M ở pH = 4,3. Nồng độ glucose huyết được kiểm tra ở thời điểm trước và sau khi tiờm 5 ngày. Những con chuột cú đường huyết cao ≥ 18mmol/l và ổn định sẽ được chọn để cho uống cao cỏc phõn đoạn dịch chiết trong vũng 21 ngày. Hàm lượng insulin huyết thanh cũng được kiểm tra để khẳng định mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2. [10]
2.2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu quả hạ glucose huyết ở chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm của dịch chiết tổng số và các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh.
Sử dụng các con chuột ĐTĐ typ 2 ở trên, tiến hành phân lô( 8 con /lô) và được điều trị như sau:
Bảng 2.3. Điều trị chuột ĐTĐ bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh
Thứ tự Phương pháp điều trị Liều uống
Lô 1 Chuột ĐTĐ + uống nước cất( nhóm đối chứng bệnh)
Lô 2 Chuột ĐTĐ + uống cao dịch chiết tổng số 1100mg/kg/ngày Lô 3 Chuột ĐTĐ + uống cao dịch chiết tổng số 2200mg/kg/ngày Lô 4 Chuột ĐTĐ +uống cao phân đoạn n- hexan 1100mg/kg/ngày Lô 5 Chuột ĐTĐ +uống cao phân đoạn n- hexan 2200mg/kg/ngày Lô 6 Chuột ĐTĐ + uống cao phân đoạn CHCl3 1100mg/kg/ngày Lô 7 Chuột ĐTĐ + uống cao phân đoạn EtOAc 1100mg/kg/ngày
Lô 8 Chuột ĐTĐ + uống metformin 500mg/kg/ngày
Chuột được điều trị bằng cách cho uống hàng ngày, trong vòng 3 tuần (21 ngày). Trước khi cho chuột uống các cao dịch chiết, chuột được nhin đói nhằm tránh sự ảnh hưởng của thức ăn đến quá trình hấp thụ cao dịch chiết. Nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột được theo dõi vào các thời điểm: trước khi tiến hành điều trị, sau điều trị 1,2,3 tuần
Vào thời cuối cùng của thời kỳ thí nghiệm, sau khi kiểm tra glucose huyết, tiến hành lấy máu tổng số của chuột để xác định các chỉ số lipid huyết thanh.
2.2.3.5. Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh (glucose, lipid máu)
Các xét nghiệm hóa sinh máu được thực hiện nhờ máy phân tích hóa sinh tự động Olympus AU640 (Nhật Bản) [13], [48],[50].
2.2.3.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết
Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi
chuột. Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít
phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O- Dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2).
Glucose + H2O2 + O2 axit gluconic + H2O2 (1) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)
Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng.
2.2.3.5.2. Định lượng Triglycerid huyết thanh [5], [19]
Nguyên lý: Thuỷ phân Triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng
glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Triglycerid lipoproteinlipase Glycerol + acid béo Glycerol + ATP glycerolkinase Glycerol–3–phosphate + ADP
Glycerol–3–phosphate +O2 glycerol 3phosphateoxidase Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
H2O2 + aminoantipyrine + 4–chlorophenol peroxidase quinonimin + 4HCl + 4H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm
(máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả
2.2.3.5.3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh
Nguyên lý: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol
của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:
Cholesterol este + H2O CHE Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 CHO Cholesterol–3– one + H2O2 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Peroxidase Quinonimin + H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm (
máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả
2.2.3.5.4. Định lượng HDL C
Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu, bước thứ nhất cholesterol
trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá huỷ bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL.
Bước 1 :
CHE +CHO
Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon +H2O
Điều kiện đặc biệt
2H2O Catalase 2H2O + O2 Bước 2: Surfactant đặc hiệu HDL CHE+CHO Cholestenon + H2O
H2O + Chromogen Peroxidase Sắc tố quynon