2.1.3.1 Dụng cụ
+ Bình ngâm mẫu 10 lit ( 3 bình) + Cân kỹ thuật (GM612, Đức)
+ Tủ sấy(Memert, Đức), thiết bị cô thu hồi dung môi và các thiết bị thường dùng khác trong phòng thí nghiệm hoá sinh như: pipetman, bình nón, ống đong, cân điện tử…
+ Máy li tâm lạnh
+ Máy phân tích các thành phần lipid, glucose máu và lipase máu nhờ máy tự động OLYMPUS AU640 của Nhật Bản.
+ Máy đo đường huyết tự động One touch Ultra2, USA
Hình 2.2. Máy đo đường huyết tự động One touch Ultra2 +Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác trong phòng thí nghiện
2.1.3.2 Hoá chất:
Hình 2.3. Streptozotocin + Metformin HCl (Samchundang Pharm).
+Dung môi hữu cơ: ethanol, n – hexan,chlorofom, ethylaxetate. +Silica gel 60 ( 0,04- 0,063) Merck.
+ Natri citrate , Natri citric. 2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết cao tổng số và các phân đoạn hợp chất tự nhiên 2.2.1.1 Chiết cao tổng số: 5 kg vỏ quả quất cảnh khô được chiết làm 2.2.1.1 Chiết cao tổng số: 5 kg vỏ quả quất cảnh khô được chiết làm
3 lần với etanol 90%. Khi cho dung môi vào mẫu( với tỉ lệ Mẫu : Dung môi = 1: 3 ), khuấy đều , dung dịch và mẫu được ngâm trong vòng 1 tuần ( mỗi ngày khuấy đều một lần ). Sau một tuần tiến hành chiết dung môi và lọc qua giấy lọc Whatman N0.1, gom các dịch lọc thu loại dung môI trên máy cô chân không ở 30 – 400 C thu được cao tổng số.Cao tổng số thu được bớt lại một phần nhỏ còn lại còn lại tiếp tục tiến hành chiết trong các dung môI hữu cơ khác.
2.2.1.2. Chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên: Hoà tan cao tổng số
trong một thể tích tối thiểu nước ấn cho tới khi hoà tan hoàn toàn, sau đó tiến hành chiết phân đoạn qua các dung môI với độ phân cực tăng dần: n – hexan -Chlorofom- ethylacetate.Mỗi phân đoạn được chiết 3 lần theo tỉ lệ dung dịch(
nước+cao cồn): dung môi= 1:1 về thể tích. Thu loại dung môI dưới áp suất giảm, thu được cao các phân đoạn tương ứng.
2.2.2. Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của vỏ quả quất cảnh
2.2.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên trong vỏ quả quất cảnh
2.2.2.1.1. Định tính flavonoids
Mẫu thử được pha trong ethanol với một lượng thích hợp, thêm vài giọt HCl đặc.
- Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống
đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng vớii acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm:
một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy
lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính .
2.2.2.1.2. Định tính tannins
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu v o 2 ống nghiệm: một
ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
- Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào
2.2.2.1.3. Định tính các polyphenols khác
- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử được pha như trên.
Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.2.1.4. Định tính glycoside Phản ứng Keller-Killian:
Thuốc thử Keller-Killian:
Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10%.
Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc.
Phương pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
2.2.2.1.5. Định tính alkaloids
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): phản ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
- Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nước): phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung d ch acid acetic): phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.2.2.2. Định lượng hợp chất polyphenols tổng số theo phương pháp Folin - Ciocalteau
Định lượng polyphenols tổng số của dịch chiết ban đầu theo phương pháp Folin-Ciocalteau. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất polyphenols trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bước sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn [55], [58], [62].
- Cân 10 mg mỗi loại cao và hòa loãng trong 1ml ethanol 90%
- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
Tiến hành:
a) Cho vào mỗi cóng định lượng 20l mẫu thử + 1,58ml H2O + 100l thuốc thử Folin – Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300l Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch trong 2h ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn. Xây dựng đường chuẩn với acid gallic như sau:
b) Cân 0,5g (500mg) acid gallic + 10ml cồn tinh khiết 90% hoà tan hết, thêm 90ml nước cất, lắc đều sẽ được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 5mg acid gallic/ml.
c) Chuẩn bị cóng (ống nghiệm) và cho vào đó số lượng dung dịch gốc chuẩn là 0, 1, 2, 3, 5 và 10ml. Sau đó dẫn nước cất đến 100ml sẽ thu được các nồng độ ở các ống nghiệm như sau: 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg acid chuẩn gallic/l. Tiếp theo tiến hành so màu theo hướng dẫn ở mục a) cùng với mẫu thử (mẫu thí nghiệm) ở đây mẫu chuẩn là 2l dung dịch chuẩn acid gallic.
Bảng2.2. Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn acid gallic STT Acid gallic (mg/l) OD765 nm 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg/l axit gallic O D 7 65 nm OD 765nm
Hình 2.4. Kết quả xây dựng đồ thị chuẩn acid gallic
2.2.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc kí mỏng ( TLC - Thinlayer chromatorgaphy) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết nhanh một số thành phần có trong mẫu nghiễn cứu. Trong phương pháp sắc kí mỏng thành phần hoá học được xác định nhờ so sánh hệ lưu của hoá học ( Rf) và hệ số lưu của một số chất đã biết [20].
Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của chất khác nhau
với pha tĩnh ( bản mỏng) và pha động ( hệ dung môi chạy sắc kí). Pha tĩnh có y = 0,001x + 0,0128 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thể là silicagel, bột AL2O3 hoặc polyamide… Pha động là một hỗn hợp từ 2 dung môi trở lên với mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
Phương pháp: Các mẫu ( đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến
hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC- Alufolien 60F254( Merkc 1,01715) kích thước phù hợp với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra một hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ dung môi:[9], [58]
- TEAF: 5:3:1:1 ( Toluen - ethylaxetate – acetone - axit foocmic) - Toluen - ethylaxetate - axit formic: 5 :4 :1.
- Ethylaxetate - axit formic- nước: 8:1:1.
Hiện màu bằng dung dịch H2SO410% được phun đều trên bản mỏng, xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức Rf= a/b
- a: Khoảng di chuyển của chất nghiên cứu - b: Khoảng di chuyển của dung môi
Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254. Hệ dung môi chạy sắc ký là toluen : ethylaxetate : acid
formic=5:4:1 thì cho kết quả màu tốt nhất.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh chiết từ vỏ quả quất cảnh
2.2.3.1. Thử độc tính theo đường uống, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết vỏ quả quất cảnh theo đường uống là xác định liều gây chết 50% số chuột thí nghiệm [40].Chuột nuôi thí nghiệm cho ăn thức ăn chuẩn trong thời gian 6 tuần và tiến hành cho uống thử độc tinh theo liều tăng dần bắt đầu từ 8g ,10g,12,14, đến 16g/kg thể trọng (liều tối đa cho phép), theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của vỏ quả quất cảnh.
2.2.3.2 Phương pháp xây dựng mô hình chuột béo phì bằng thức ăn
Mô hình chuột béo phì thực nghiệm được xây dựng trên dòng chuột nhắt chủng Swiss bằng chế độ thức ăn giàu chất béo, cholesterol và cacbonhydrate theo bảng 2.1 [13], [37], [46].
Phương pháp:
Chuột nhắt chủng Swiss được chia làm 2 nhóm và chăm sóc với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau như sau:
+ Nhóm 1: Chuột ăn thức ăn chuẩn( nhóm đối chứng)
+ Nhóm 2: Chuột ăn thức ăn giàu chất béo/cholesterol/cacbohydrate
được phối trộn từ nguồn thức ăn có sẵn ở Việt Nam( Bảng 2.1)
Chuột được chăm sóc trong vòng 6 tuần, trọng lượng chuột theo dõi hàng tuần. Vào ngày cuối cùng của thời kỳ nuôi béo, lựa chọn từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, cho nhịn đói 12h sau đó lấy máu tổng thể phân tích một số chỉ số lipid( Cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-C, LDL-C, lipase), hàm lượng glucose huyết.
2.2.3.3.Phương pháp gây rối loạn trao đổi glucose máu của chuột béo phì thực nghiệm bằng Streptozotocin(STZ) liều thấp
Mô hình chuột ĐTĐ typ 2 được xây dựng trên chuột béo phì kết hợp với tiêm STZ liều thấp qua tham khảo từ nhiều tác giả khác nhau [45], [51], [52], [56], [57].
Phương pháp:
Chuột nuụi với chế độ ăn giàu chất bộo sau 6 tuần ở trờn, Sau 12h cho nhịn đúi, tiến hành tiờm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg thể trọng) pha trong đệm citrate 0,01M ở pH = 4,3. Nồng độ glucose huyết được kiểm tra ở thời điểm trước và sau khi tiờm 5 ngày. Những con chuột cú đường huyết cao ≥ 18mmol/l và ổn định sẽ được chọn để cho uống cao cỏc phõn đoạn dịch chiết trong vũng 21 ngày. Hàm lượng insulin huyết thanh cũng được kiểm tra để khẳng định mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2. [10]
2.2.3.4 Phương pháp đánh giá hiệu quả hạ glucose huyết ở chuột ĐTĐ typ 2 thực nghiệm của dịch chiết tổng số và các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả quất cảnh.
Sử dụng các con chuột ĐTĐ typ 2 ở trên, tiến hành phân lô( 8 con /lô) và được điều trị như sau:
Bảng 2.3. Điều trị chuột ĐTĐ bằng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả quất cảnh
Thứ tự Phương pháp điều trị Liều uống
Lô 1 Chuột ĐTĐ + uống nước cất( nhóm đối chứng bệnh)
Lô 2 Chuột ĐTĐ + uống cao dịch chiết tổng số 1100mg/kg/ngày Lô 3 Chuột ĐTĐ + uống cao dịch chiết tổng số 2200mg/kg/ngày Lô 4 Chuột ĐTĐ +uống cao phân đoạn n- hexan 1100mg/kg/ngày Lô 5 Chuột ĐTĐ +uống cao phân đoạn n- hexan 2200mg/kg/ngày Lô 6 Chuột ĐTĐ + uống cao phân đoạn CHCl3 1100mg/kg/ngày Lô 7 Chuột ĐTĐ + uống cao phân đoạn EtOAc 1100mg/kg/ngày (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô 8 Chuột ĐTĐ + uống metformin 500mg/kg/ngày
Chuột được điều trị bằng cách cho uống hàng ngày, trong vòng 3 tuần (21 ngày). Trước khi cho chuột uống các cao dịch chiết, chuột được nhin đói nhằm tránh sự ảnh hưởng của thức ăn đến quá trình hấp thụ cao dịch chiết. Nồng độ glucose huyết lúc đói của chuột được theo dõi vào các thời điểm: trước khi tiến hành điều trị, sau điều trị 1,2,3 tuần
Vào thời cuối cùng của thời kỳ thí nghiệm, sau khi kiểm tra glucose huyết, tiến hành lấy máu tổng số của chuột để xác định các chỉ số lipid huyết thanh.
2.2.3.5. Phương pháp định lượng một số chỉ số hoá sinh (glucose, lipid máu)
Các xét nghiệm hóa sinh máu được thực hiện nhờ máy phân tích hóa sinh tự động Olympus AU640 (Nhật Bản) [13], [48],[50].
2.2.3.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết
Máu sử dụng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi
chuột. Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít
phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kit thử với glucose trong máu tạo thành axit gluconic và H2O2 (phản ứng 1). H2O2 tạo thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hoá O- Dianisidin tạo phức chất mầu vàng nâu (phản ứng 2).
Glucose + H2O2 + O2 axit gluconic + H2O2 (1)
O-Dianisidin + H2O2 phức hợp nâu vàng + H2O2 (2)
Cường độ mầu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong máu cần định lượng.
2.2.3.5.2. Định lượng Triglycerid huyết thanh [5], [19]
Nguyên lý: Thuỷ phân Triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng
glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyryl và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Triglycerid lipoproteinlipase Glycerol + acid béo Glycerol + ATP glycerolkinase Glycerol–3–phosphate + ADP
Glycerol–3–phosphate +O2 glycerol 3phosphateoxidase Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
H2O2 + aminoantipyrine + 4–chlorophenol peroxidase quinonimin + 4HCl + 4H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm
(máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả
2.2.3.5.3. Định lượng cholesterol toàn phần trong huyết thanh
Nguyên lý: Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol
của quinonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4- aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:
Cholesterol este + H2O CHE Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 CHO Cholesterol–3– one + H2O2 2H2O2 + 4 – aminophenazone + phenol Peroxidase Quinonimin + H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bước sóng 546 nm (
máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả
2.2.3.5.4. Định lượng HDL C
Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu, bước thứ nhất cholesterol
trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá huỷ bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL.
Bước 1 : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHE +CHO
Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon +H2O
Điều kiện đặc biệt
2H2O Catalase 2H2O + O2 Bước 2: Surfactant đặc hiệu HDL CHE+CHO Cholestenon + H2O
H2O + Chromogen Peroxidase Sắc tố quynon
Tất cả các số liệu thực nghiệm được biểu diễn dưới dạng số trung bình sai số. Sử dụng các phép thử t- test trên phần mềm Exel 2003, PSSS – 16, phân tích phương sai một nhân tố để đánh giá sự khác nhau giữa các giá trị với mức ý nghĩa thống kê nếu p ≤ 0,05.
CHƯƠNG 3
KếT QUả Và THảO LUậN
3.1. QUY TRèNH TÁCH CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ VỎ QUẢ QUẤT CẢNH QUẤT CẢNH
Quy trỡnh tỏch chiết cú ảnh hưởng quan trọng đến việc phõn lập cỏc hợp chất tự nhiờn trong thực vật. Qua tham khảo cỏc tài liệu chỳng tụi lựa chọn quy trỡnh tỏc chiết được mụ tả như ở hỡnh 3.1.
VỎ QUẢ QUẤT CẢNH (1kg)
Cao cồn tổng số (134,25g)
Ngõm kiệt 3 lần với EtOH, lọc thu dịch chiết sau đú cụ loại dung mụi dưới ỏp
Chiết phõn đoạn 3 lần với CHCl3 (1:1)
Chiết phõn đoạn 3 lần với EtOAc (1:1)
Cụ loại dung mụi
Cụ loại dung mụi
Phõn lớp hexan
Phõn lớp CHCl3 Phõn lớp nước
Hoà tan trong nước, chiết phõn đoạn 3 lần với n-hexan (1:1) Phõn lớp nước Cao PĐ n-hexan