2.1.2.1. Thiết bị, máy móc nghiên cứu
- Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S, độ nhạy10-2g (Đức). - Cân phân tích Mettler Toledo AB204S, độ nhạy 10-4
g (Thụy Sỹ). - Máy cất quay Buchi B491 (Thụy Sỹ).
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ). - Máy đo pH (Đức).
- Máy khuấy từ gia nhiệt (Đức). - Phân cực kế A. ksuss (Đức).
- Tủ sấy Memmert (Đức).
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton 1
H-NMR Brucker AV- 500MHz (Mỹ) của Viện Hóa học -Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Mỹ) của Viện Hoá học-Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ khối lƣợng Agilent 6310 Ion Trap (Đức) của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ khối lƣợng LC-MSD-Trap-SL (Đức) của Viện Hoá học -Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Máy đo phổ khối lƣợng phân giải cao FT-ICR-MS-Varian 910MS (Đức) của Viện Hoá học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2.2. Dụng cụ
- Bản mỏng Silicagel GF254 (Đức).
- Bình cầu 2 cổ; 3 cổ dung tích: 100ml, 1000ml (Đức). - Bình cầu đáy tròn, 1 cổ dung tích: 100ml (Đức). - Bình phun sắc ký (Trung Quốc).
- Cốc có mỏ dung tích: 100ml, 250ml, 500ml (Đức) - Phễu và bình lọc Buchner (Trung Quốc).
22 - Nhiệt kế thủy ngân (Trung Quốc).
- Pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml (Trung Quốc).
- Ống đong dung tích: 25ml, 50ml, 100ml, 500ml (Trung Quốc). 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tổng hợp hoá dƣợc: Tổng hợp L-dopa từ nguyên liệu L-tyrosin có nguồn gốc trong nƣớc (Phòng Tổng hợp Hoá dƣợc-Bộ Môn Công nghiệp Dƣợc- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội). Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa con đƣờng tổng hợp của các tác giả L. Bernardi và cộng sự (1970) [12], H. Bretscheneider và cộng sự (1973) [49], W. T. Brady (1957) [13] để khảo sát. - Tinh chế các hợp chất trung gian và sản phẩm.
- Xác định độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm.
- Khẳng định cấu trúc phân tử của các chất trung gian và sản phẩm cuối cùng của quy trình tổng hợp.
- Xác đinh một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng L-dopa theo chuyên luận trong Dƣợc điển Anh 2009.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Tiến hành tổng hợp LD từ L-tyrosin theo sơ đồ sau:
23
2.3.2. Tinh chế sản phẩm và các chất trung gian
Sử dụng các phƣơng pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tách và tinh chế các chất trung gian và sản phẩm tạo thành.
2.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất trung gian và sản phẩm
Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu đƣợc bằng phƣơng pháp SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy và đo năng suất quay cực.
SKLM: Tính hệ số lƣu giữ Rf
- Dung môi hòa tan: dd HCl 1N, ethanol, ethyl acetat.
- Dung môi khai triển: n-butanol: acid acetic: nƣớc cất với các t lệ khác nhau.
- Thuốc thử hiện màu: Dung dịch ninhydrin 0,1% trong aceton
2.3.4. Xác định cấu trúc sản phẩm
Phổ hồng ngoại (IR): Phổ hồng ngoại đƣợc tiến hành ghi trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1, ghi phổ ở độ phân giải 4cm-1.
Phổ khối lƣợng (MS): Phổ khối lƣợng đƣợc ghi trên máy đo khối phổ Agilent 6310 Ion Trap, LC-MSD-Trap-SL, và máy đo phổ khối lƣợng phân giải cao FT-ICR-MS-Varian 910MS theo phƣơng pháp ion hóa phun bụi điện tử (ESI).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): đƣợc ghi trên máy Brucker AV- 500MHz, độ dịch chuyển hóa học δ đƣợc tính theo chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS) [1,8].
2.3.5. Xác định một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng sản phẩm theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009 chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009
Xác định một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng LD theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009. BP 2009 quy định hàm lƣợng LD phải chứa từ 99,0% đến 101,0% acid (2S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic, tính theo chế phẩm đã làm khan [45].
24
2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
25
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. TỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN
3.1.1. Tổng hợp L-tyrosin methyl ester (9)
Cho vào bình cầu hai cổ thể tích 1000ml: 15,0g (0,083mol) L-tyrosin (2), 400ml CH3OH. Khuấy tạo hỗn dịch. Nhỏ từ từ 10ml H2SO4 đặc đến khi dung dịch đồng nhất. Đun hồi lƣu hỗn hợp trong 12h. Kiểm tra phản ứng bằng SKLM. Sau phản ứng, hỗn hợp phản ứng để nguội về nhiệt độ phòng, cất thu hồi methanol. Cắn thu đƣợc hòa tan trong 100ml nƣớc, làm lạnh. Sau đó điều chỉnh pH dung dịch về 9 bằng dd Na2CO3 bão hòa, xuất hiện kết tủa. Lọc, thu đƣợc 12,46g tủa thô 9.
Tinh chế tủa thô 9: hòa tan 12,46 gam 9 trong 50,0ml dung dịch HCl 1M, làm lạnh rồi điều chỉnh pH dung dịch về 9 bằng dd Na2CO3 bão hòa, xuất hiện tủa. Lọc thu đƣợc tủa 9. Rửa tủa 9 bằng nƣớc lạnh (3 lần), thu đƣợc 10,86g sản phẩm 9. Nhiệt độ nóng chảy 134 -136oC. Hiệu suất 67,2%.
Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM khai triển với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nƣớc (6 : 2 : 2,5). Hiện màu bằng thuốc thử ninhydrin 0,1%/aceton. Kết quả đƣợc biểu diễn dƣới hình sau:
SKLM của hỗn hợp phản ứng sau 6h
SKLM của sản phẩm tinh khiết
26
Nhận xét: Kết quả cho thấy sản phẩm 9 có giá trị hệ số lƣu giữ khác nguyên liệu. Trong hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nƣớc cất = 6 : 2 : 2,5, sản phẩm tạo thành cho một vết tròn, màu cam đậm có Rf là 0,69 so với nguyên liệu có Rf là 0,47. Nhƣ vậy có thể kết luận sơ bộ sản phẩm thu đƣợc đã loại bỏ hoàn toàn nguyên liệu và không có tạp.
3.1.2. Tổng hợp O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10)
Lấy 18,0ml pyridin cho vào bình cầu 2 cổ dung tích 100ml. Nghiền nhỏ 5,85g 9 (30,0 mmol) cho vào dung môi đã chuẩn bị ở trên. Sau đó nhỏ từ từ 8,5ml anhydrid acetic (90,0 mmol) vào hỗn hợp trên cho đến khi nguyên liệu
9 tan hết sao cho nhiệt độ không quá 25oC. Khuấy tiếp khối phản ứng ở nhiệt độ này trong 5 giờ. Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 100,0ml ethyl acetat. Khuấy rồi chiết với dung dịch HCl 1M (3 lần, mỗi lần 70,0ml) để loại pyridin. Cuối cùng, rửa bằng nƣớc thu đƣợc pha hữu cơ chứa sản phẩm. Làm khan bằng 10,0g natri sulfat khan. Sau đó, cất thu hồi dung môi đến khi thu đƣợc dạng siro. Thêm 10ml ethyl acetat và khuấy cho tan hoàn toàn, sau đó thêm 10ml ether dầu hỏa, khuấy thu đƣợc kết tủa. Lọc, sấy thu đƣợc 6,2g tủa thô 10.
Tủa thô 10 đƣợc tinh chế nhƣ sau: Hòa tan hoàn toàn 6,2g tủa thô 10
trong 50ml ethanol 50% sôi, khuấy 15 phút, sau đó làm lạnh. Để kết tinh lạnh qua đêm, xuất hiện tinh thể màu trắng. Lọc, sấy tới khối lƣợng không đổi thu đƣợc 4,2g 10 tinh khiết (tonc 105-107oC).
Để tìm đƣợc các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tổng hợp (2S)-2- acetamido-3-(4-acetoxyphenyl)propanoat với hiệu suất cao nhất, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quy trình: Thời gian phản ứng và t lệ mol các chất tham gia phản ứng.
3.1.2.1. Khảo sát thời gian tiến hành phản ứng
Để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng, tiến hành phản ứng nhƣ quy trình trên với các thông số sau:
27 - Dung môi phản ứng: pyridin.
- Nhiệt độ phản ứng là 25oC.
- T lệ mol Ac2O: sản phẩm ester = 3,0/ 1. Khối lƣợng L-tyrosin methyl ester là 1,0 gam.
- Thời gian khảo sát: 1, 2, 3, 4 và 5 giờ Thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng acyl hóa
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy thời gian phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng. Khi thời gian phản ứng tăng hiệu suất phản ứng tăng lên. Khi thời gian phản ứng tăng lên 4h thì hiệu suất phản ứng đạt tốt nhất. Và kéo dài thêm phản ứng lên 5h thì hiệu suất không thay đổi.
= Do vậy, thời gian phản ứng đƣợc chọn là 4h cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2.2. Khảo át t lệ mol các chất th m gi phản ứng
Để đánh giá ảnh hƣởng của tỉ lệ mol chất tham gia phản ứng, các thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ trên với điều kiện phản ứng:
- Dung môi phản ứng: pyridin.
- Phản ứng thực hiện ở nhiệt độ phòng (khoảng 25oC). - Thời gian: 4h.
- T lệ mol Ac2O/sản phẩm ester = 2,00/1; 2,25/1; 2,50/1; 2,75/1; 3,00/1. Khối lƣợng L-tyrosin methyl ester sử dụng là 1,0g.
STT Thời gian phản ứng (h) KL sản phẩm (g) Hiệu suất (%) Nhiệt độ n ng chả o C) 1 1 0,74 51,72 104-105 2 2 0,80 55,91 104-106 3 3 0,95 66,39 103-105 4 4 1,07 74,78 104-106 5 5 1,06 74,09 104-106
28 Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của t lệ mol anhydrid acetic: ester 9
đến hiệu suất phản ứng acyl hóa
Nhận xét: Kết quả thu đƣợc cho thấy khi t lệ mol anhydrid acetic: L- tyrosin methyl ester = 2,25: 1 thì hiệu suất phản ứng là lớn nhất 76,88%.
Qua khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng, thu đƣợc các thông số tốt nhất cho phản ứng tổng hợp O,N-diacyl-L-tyrosin methyl ester từ L-tyrosin methyl ester với hiệu suất cao nhất (76,88%) nhƣ sau:
- Dung môi phản ứng: pyridin
- Phản ứng thực hiện ở nhiệt độ phòng (khoảng 25oC) - Thời gian phản ứng: 4h
- T lệ mol Ac2O và ester 9 = 2,25/ 1.
Sau khi tìm đƣợc các thông số tốt nhất cho quy trình tổng hợp O,N- diacetyl-L-tyrosin methyl ester, tiến hành phản ứng với quy mô lớn hơn để khảo sát tính ổn định của quy trình. Kết quả, các sản phẩm thu đƣợc từ các mẻ đều có nhiệt độ nóng chảy 105-107oC với hiệu suất nhƣ bảng sau:
Bảng 3.3. Kết quả thực hiện phản ứng ở quy mô lớn
STT KL L-tyrosin
methyl ester (gam)
KL Ac2O (g) Thể tích Ac2O (ml) KL sản phẩm (g) Hiệu suất (%) Mẻ 1 23,4 27,59 25,5 25,76 76,94 Mẻ 2 23,4 27,59 25,5 25,53 76,25 STT T lệ mol Ac2O : Ester KL sản phẩm (g) Hiệu suất phản ứng (%) Nhiệt độ n ng chả o C) 1 2,00/1 1,00 69,89 105-107 2 2,25/1 1,10 76,88 105-107 3 2,5/1 1,08 75,48 105-107 4 2,75/1 1,06 74,09 105-107 5 3,00/1 1,06 74,09 104-106
29
Mẻ 3 23,4 27,59 25,5 25,85 77,21
Trung bình: 25,71 76,8
Nhận xét: Quy trình phản ứng ổn định, vẫn cho hiệu suất tƣơng tự khi quy mô phản ứng đƣợc nâng cấp. Tuy nhiên, để nghiên cứu phản ứng ở quy mô lớn hơn, cần tìm dung môi khác thay thế pyridin để tránh gây ô nhiễm môi trƣờng.
3.1.3. Tổng hợp ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)–N-acetyl-L-alanin (11)
Cho vào bình cầu 1 cổ, dung tích 100ml: 3,0g (10,75 mmol) nguyên liệu
10 và 36,0ml nitrobenzen. Khuấy cho tan hết. Sau đó, thêm vào bình cầu 3,6g (26,96 mmol) AlCl3 khan, hỗn hợp đƣợc đun trong khoảng 4h ở nhiệt độ 100- 130oC.
Sau khi phản ứng kết thúc: Khảo sát phƣơng pháp tinh chế sản phẩm 11
theo hai phƣơng pháp của các tác giả L. Bernardi và cộng sự (1970) [12], H. Bretscheneider và cộng sự (1973) [49] và cải tiến các phƣơng pháp trên. Sau khi tìm đƣợc phƣơng pháp tinh chế sản phẩm, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng chuyển vị: xúc tác, nhiệt độ và t lệ mol diacyl 10 so với xúc tác.
3.1.3.1. Khảo át phương pháp tinh chế sản phẩm
Phương pháp 1: phương pháp của tác giả L. Bernardi và cộng sự:
Tiến hành: Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình cầu về dƣới 10oC và thêm 34,0ml nƣớc vào. Thêm dần dần 5,5g natri carbonat vào hỗn dịch trên, khuấy. Sau đó tách nitrobenzen bằng cất kéo hơi nƣớc. Nhôm hydroxyd dạng gel đƣợc lọc nóng và dạng đóng bánh đƣợc hấp thụ vào nƣớc vài lần, lọc thu dịch. Rửa tủa với dd HCl. Dịch lọc kết hợp với nƣớc rửa HCl đƣợc chiết với ethyl acetat (3 lần, mỗi lần 10,0ml). Làm khan pha dung môi với Na2SO4
khan. Cất thu hồi ethyl acetat thu đƣợc 5,3g siro. Không kết tinh đƣợc sản phẩm 11.
30
Nhận xét:
Khi thực hiện theo phƣơng pháp này, rất khó cất kéo hơi nƣớc để thu hồi nitrobenzen trong hỗn dịch chứa tủa keo nhôm hydroxyd đó. Cách này mất rất nhiều thời gian và sản phẩm vẫn lẫn nitrobenzen.
Khó lọc tủa nhôm hydroxyd dạng keo.
Không kết tinh đƣợc sản phẩm 11.
Phương pháp 2: Cải tiến phương pháp của tác giả tác giả B. Luigi và cộng
sự:
Tiến hành: Dựa theo phƣơng pháp 1, lọc loại bỏ tủa keo nhôm hydroxyd trƣớc khi cất kéo hơi nƣớc loại nitrobenzen.
Nhận xét:
Rất khó lọc tủa nhôm hydroxyd dạng keo, sản phẩm lẫn theo tủa mất đi nhiều, thời gian lọc rất lâu.
Cất kéo hơi nƣớc để thu hồi nitrobenzen đã dễ hơn nhƣng sản phẩm vẫn bị lẫn nitrobenzen.
Khó kết tinh đƣợc sản phẩm 11.
Phương pháp 3: Phương pháp của tác giả H. Bretscheneider và cộng sự:
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm 5,7 ml HCl đặc và 57,0g nƣớc đá. Lớp nitrobenzen đƣợc tách ra. Pha nƣớc đƣợc chiết với 200,0ml ethyl acetat. Thu lấy pha hữu cơ. Chiết pha hữu cơ với dd NaOH 2N (lần 1 với 11,5ml, lần 2 với 3ml). Sau đó điều chỉnh pH về 1 bằng HCl đặc.
Nhận xét :
Nitrobenzen và nhôm clorid đã đƣợc loại dễ dàng hơn, không tốn năng lƣợng trong việc lọc và cất kéo hơi nƣớc.
31
Phương pháp 4 : Cải tiến phương pháp của tác giả H. Bretscheneider và
cộng sự :
Tiến hành : Hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh, thêm 60,0ml nƣớc đá. Khuấy trong 15 phút tạo hỗn dịch. Thêm tiếp 6,0ml HCl đặc. Khuấy trong 30 phút. Chiết hỗn hợp 2 lần bằng ethyl acetat (lần 1 với 100,0ml, lần 2 với 70,0ml). Thu lấy dịch chiết pha hữu cơ. Chiết pha hữu cơ bằng NaOH 2N hai lần (lần 1 11,0ml, lần 2 3,0ml). Thu lấy dịch chiết pha nƣớc. Loại nitrobenzen còn lẫn trong pha nƣớc bằng 30,0 ethyl acetat. Sau đó pha nƣớc đƣợc làm lạnh về 5oC và đƣợc điều chỉnh về pH 1 bằng HCl đặc. Để lạnh 2h, 11 bắt đầu kết tinh. Lọc, rửa với nƣớc lạnh thu đƣợc tủa 11. Sấy khô tủa thu đƣợc hợp chất 11. Nhiệt độ nóng chảy 146-148oC.
Nhận xét :
Đã loại đƣợc hoàn toàn nitrobenzen và nhôm clorid, không tốn năng lƣợng trong việc lọc và cất kéo hơi nƣớc.
Đã kết tinh đƣợc sản phẩm 11 tinh khiết.
Do vậy, phƣơng pháp 4 đƣợc lựa chọn để tinh chế thu sản phẩm. - Kiểm tra độ tinh khiết 11 bằng sắc ký lớp mỏng :
32
Nhận xét: Kết quả cho thấy sản phẩm tạo thành cho một vết tròn có Rf là 0,88 so với Rf của nguyên liệu là 0,61. Nhƣ vậy sản phẩm thu đƣợc đã loại bỏ hoàn toàn nguyên liệu và không có tạp.
3.1.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng
Để khảo sát ảnh hƣởng của chất xúc tác tới phản ứng chuyển vị, thực hiện phản ứng theo quy trình trên, sử dụng các điều kiện xúc tác khác nhau: nhôm clorid khan/nitrobenzen, nhôm clorid khan trực tiếp [51]. Lƣợng nguyên liệu 10 sử dụng là 1,5g. Nhiệt độ phản ứng là 130-135oC. Thời gian phản ứng là 4h.
Với phản ứng có dung môi:
Tiến hành phản ứng nhƣ trên với lƣợng xúc tác: 1,8g nhôm clorid khan; 18,0ml nitrobenzen.
Tinh chế: Theo phƣơng pháp 4 đƣợc chọn ở trên.
Kết quả:
Thu đƣợc 0,5g sản phẩm 11
Nhiệt độ nóng chảy: 146-148oC