Dựa vào tính chất vật lý, hóa học của L-dopa và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình tinh chế L-dopa đạt hiệu suất cao. Quy trình tinh chế này thực hiện đơn giản, tốn ít thời gian, sử dụng các hóa chất thông thƣờng, ít độc hại và ít gây ô nhiễm môi trƣờng. Áp dụng quy trình tinh chế này, L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo BP 2009. Với quy trình tinh chế này, hoàn toàn có thể áp dụng với các quy mô thí nghiệm lớn hơn. 4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM
4.2.1. Phồ hồng ngoại
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép phân tích đƣợc các dải hấp thụ đặc trƣng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất đƣợc ghi phổ. Do đó, việc phân tích phổ hồng ngoại chủ yếu xác định nhóm chức để thấy đƣợc quá trình phản ứng tạo thành sản phẩm có nhóm chức mong muốn. Ngoài ra, phổ IR
51
đƣợc sử dụng để xác định tính đồng nhất của 2 mẫu chất: chất tổng hợp đƣợc và chất đã biết. Ứng dụng này đặc biệt có ý nghĩa định tính sản phẩm L-dopa.
Trên phổ IR của các chất đƣợc trình bày ở bảng 3.10 đều xuất hiện các dao động hóa trị đặc trƣng cho các nhóm chức có trong công thức của các chất.
- Trên phổ IR của chất trung gian 9 có thấy xuất hiện các dải hấp thụ tƣơng ứng với dao động hóa trị của nhóm -C=O ester (1731 cm-1). Chứng tỏ trong cấu trúc của 9 có nhóm ester và phản ứng ester hoá 2 đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 10 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 1745 cm-1 của nhóm -C=O ester có và đỉnh hấp thụ 1633 cm-1 của nhóm -C=O amid. Chứng tỏ đã xảy ra phản ứng O-acyl hoá và N-acyl hoá hợp chất 9. - Trên phổ IR của hợp chất 11 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 3355 cm-1 thể hiện sự xuất hiện của -OH phenol. Đồng thời xuất hiện dải hấp thụ 1726 cm-1 của nhóm -C=O ceton, đỉnh hấp thụ 1641 cm-1 của nhóm -C=O amid và đỉnh hấp thụ 1599 cm-1 của -COO- (bất đối xứng). Chứng tỏ phân tử chất 11 đã xuất hiện thêm nhóm ceton và -OH phenol so với hợp chất 10 và phản ứng chuyển vị Fries đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 1 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ 3600-3000 cm-1
của nhóm -O-H phenol và -NH3+, đỉnh hấp thụ 1658 cm-1
của nhóm carboxyl và 1570 cm-1 của -NH3
+
(bất đối xứng) có chứng tỏ đã xảy ra phản ứng oxy hoá nhóm ceton tạo -O-H phenol và các nhóm bảo vệ đã đƣợc giải phóng. Ngoài ra, dải hấp thụ khoảng 900-600 cm-1 thể hiện các giá trị thế 3 vị trí 1, 3, 4 của vòng thơm.
4.2.2. Phổ khối lƣợng
Phổ MS dùng để xác định khối lƣợng phân tử của các chất tổng hợp đuợc và số khối các mảnh ion bị phân mảnh từ công thức cấu tạo của các chất.
52
Kết quả phân tích phổ MS trong bảng 3.11 đã cho thấy phổ khối lƣợng của từng chất đều cho các đỉnh cơ bản là các đỉnh có cƣờng độ cao nhất có trị số m/z bằng khối lƣợng phân tử dự kiến của chất cần phân tích.
Đặc biệt tại phổ MS của L-dopa (phụ lục 7): phổ MS phân giải cao đã cho mảnh có m/z phù hợp với khối lƣợng của L-dopa và dự đoán công thức phân tử C9H11NO4 đúng với công thức phân tử của sản phẩm L-dopa (1).
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
Dựa vào phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất. Phổ 1H-NMR xác định sự có mặt của các nhóm có proton dựa vào độ chuyển dịch hóa học, bộ khung của hợp chất (vòng thơm…), số lƣợng proton ở C bên cạnh căn cứ vào độ bội của tín hiệu cộng hƣởng và sự có mặt của tạp chất (các tín hiệu lạ).
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.8, kết quả cho thấy:
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 11, 1 xuất hiện các pic với số lƣợng proton và vị trí proton trong các nhóm phù hợp với công thức cấu tạo các chất.
- Trên cả 2 phổ đều không thấy các tín hiệu lạ, chứng tỏ, các hợp chất 11, 1
đều tinh khiết, không lẫn tạp.
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 11 xuất hiện các tín hiệu độ dịch chuyển có giá trị 1,78 ppm của các proton trong nhóm methyl (-NH-CO-CH3), 2,62 ppm của các proton trong nhóm methyl (-CO-CH3), 4,5 ppm của proton trong nhóm -CH- (-CH-COOH), 11,89 của proton phenol, chứng tỏ hợp chất này đã có thêm nhóm -OH, -CO-CH3 gắn với nhân thơm trong phân tử và gốc acid carboxylic.
- Phổ 1H-NMR của L-dopa thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton nhân thơm, chứng tỏ trên nhân thơm có 3 nhóm thế. Cụ thể nhƣ sau δ (ppm): 6,49 (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C6’); 6,57 (1H, d (J=1,5), H-C2’) và 6,65 (1H, d (J=8,0), H- C5’). Trên phổ không thấy xuất hiện các tín hiệu proton trong nhóm methyl (-
53
CO-CH3) so với hợp chất 11, chứng tỏ trên nhân thơm 1 nhóm acetyl đã bị chuyển thành -OH và một nhóm acetyl gắn với -NH bị thủy phân.
- So sánh các giá trị (ppm) của D-dopa [16] và L-dopa trên phổ 1H-NMR thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:
Bảng 3.17. So sánh kết quả phân tích phổ của D-dopa và L-dopa
L-dopa D-dopa
Công thức cấu tạo
HO HO OH O NH2 1 2 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' Kết quả phổ 1 H-NMR 2,87 (1H, dd (J=14,5; 11,5), Ha-C3) 3,20 (1H, dd (J=14,4; 7,2), Ha-C3) 3,00 (1H, dd (J=14,5; 5,0), Hb-C3) 3,32 (1H, dd (J=14,4; 5,6), Hb-C3) 4,04 (1H, dd (J=7,0; 5,5), H-C2) 4,43 (1H, dd (J=7,2; 5,6), H-C2) 6,49 (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C6') 6,83 (1H, d (J=8,0), H-C6') 6,57 (1H, d (J=1,5), H-C2') 6,93 (1H, s, H-C2') 6,65 (1H, d (J=8,0), H-C5') 6,99 (1H, d (J=8,0), H-C5')
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR cho thấy có sự sai khác giá trị độ dịch chuyển hóa học cùng với hệ số tƣơng tác J của các H của D-dopa so với các H của L-dopa.
Từ các dữ liệu của phổ IR, phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ proton cùng với các giá trị tài liệu tham khảo [16] cho phép đề xuất hợp chất
LD chúng tôi tổng hợp đƣợc là acid (S)-2-amino-3-(3,4-
dihydroxyphenyl)propanoic.
4.3. VỀ CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU L-DOPA TỔNG HỢP ĐƢỢC Nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc đạt yêu cầu chất lƣợng các chỉ tiêu thử: tính chất, định tính, mất khối lƣợng do làm khô và định lƣợng theo BP 2009 trong Phiếu Kiểm nghiệm (Phụ lục 14). Đặc biệt, hàm lƣợng L-dopa
54
trong chế phẩm là 99,4% (nằm trong giới hạn tiêu chuẩn từ 99,0% đến 101,0% , tính theo chế phẩm đã làm khô). Các yêu cầu chất lƣợng đã thử của L-dopa đƣợc quy định trong BP 2009 tƣơng tự trong BP 2013 [44]. Nhƣ vậy, có thể kết luận, nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc đạt yêu cầu chất lƣợng các chỉ tiêu đã thử, đặc biệt là hàm lƣợng theo BP 2013.
55
KẾT UẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng đƣợc quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm (hiệu suất toàn bộ quy trình 18,37%) bao gồm 4 giai đoạn:
- Ester hóa L-tyrosin tạo L-tyrosin methyl ester (hiệu suất phản ứng đạt 67,2%).
- Acyl hóa L-tyrosin methyl ester tạo O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester. Đã khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 76,88%.
- Chuyển vị Fries O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester tạo ß-(3-acetyl-4- hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin. Đã khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 50,7%.
- Oxy hóa ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin tạo N-acetyl- L-dopa và thủy phân nhóm bảo vệ tạo L-dopa. Đã khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của lƣợng dd H2O2 7,1% sử dụng tới hiệu suất phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 86,9%.
Cấu trúc sản phẩm và các dẫn chất trung gian đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp đo phổ: IR, MS, 1
H-NMR.
2. Tổng hợp và tinh chế đƣợc L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009. L-dopa tổng hợp đƣợc có hàm lƣợng 99,4% (nằm trong giới hạn quy định từ 99,0 đến 101,0%, tính theo chế phẩm khan).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc để nghiên cứu nâng cấp quy trình tổng hợp L-dopa lên quy mô pilot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Hữu Đĩnh Trần Thị Đà (2009), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục, 199-317.
2. Nghiêm Thanh Hoàng (2005), Khảo sát một số phương pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
3. Lê Thị Luyến (2009), Bệnh học Y học, Nhà xuất bản Y học.
4. Nguyễn Đình Luyện (2009), K thuật hoá dược I, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, 60.
5. Mim.com (2013), Cẩm nang sử dụng thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
6. Hồ Hoàng Nhân (2009), Nghiên cứu cải tiến quy trình thủy phân Keratin và bàn tổng hợp N-acetyl-L-cystein, Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội, pp.
7. Nguyễn Thị Ninh (2008), Nghiên cứu cải tiến quy trình điều chế L-
cystin làm nguyên liệu bán tổng hợp N-acetyl-L-cystein, Khóa luận tốt
nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
8. Nguyễn Đình Triệu (2007), Các phương pháp phổ trong hóa học hữu
cơ và hóa sinh, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
9. Atlas D. (2011), L-DOPA amide derivatives and uses thereof, The United States Patent and Trademark Office, US 8048926 B2.
10. Bennett J. P., Piercey M. F. (1999), "Pramipexole-a new dopamine agonist for the treatment of Parkinson's disease", Journal of the neurological sciences, 163(1), 25-31.
11. Bentué-Ferrer D., Ménard G., Allain H. (1996), "Monoamine Oxidase B inhibitors", CNS drugs, 6(3), 217-236.
12. Bernardi L. Golfredo O. (1973), Process for the preparation of L-dopa, The Unites States Patent and Trademark Office, US 3717673.
13. Brady W. T. (1957), The synthesis of O-methyl-N-acetyl-L-tyrosine, California Institute of Technology.
14. Cannata V., Tamerlani G., Morotti M. (1990), Process for the synthesis of the levodopa, The United States Patent and Trademark Office, US 4962223.
15. Chattopadhyay S., Das A. (1990), "Production of L-DOPA by Aspergillus terreus", FEMS Microbiology Letters, 72(1), 195-199. 16. Chen F. Y. Uang B. J. (2001), "Enantioselective synthesis of (R)-3-(3,
4-Dihydroxyphenyl)alanine from tert-butyl glycinate", The Journal of
Organic Chemistry, 66(10), 3650-3652.
17. Deleu D., Northway M. G., Hanssens Y. (2002), "Clinical pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of drugs used in the treatment of Parkinson’s disease", Clinical pharmacokinetics, 41(4), 261-309.
18. Ellis B. E. (1976), "Dopa ring-cleavage in the biogenesis of stizolobic acid in Mucuna deeringiana", Phytochemistry, 15(4), 489-491.
19. Florent J. Lunel J. Renaut J. (1972), Process for the preparation of L-
beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-alpha-alanine by fermentation, The United
States Patent and Trademark Office, US 3703439.
20. Furniss B. S. et al. (1978), Vogel's textbook of pratical organic chemistry, 841-842.
21. Furubayashi A., Hiradate S., Fujii Y. (2007), "Role of catechol structure in the adsorption and transformation reactions of L-Dopa in soils", Journal of chemical ecology, 33(2), 239-250.
22. Haneda K., Watanabe S., Takeda I. (1971), "Synthesis of l-3, 4- Dihydroxyphenylalanine from l-Tyrosine by Microorganisms", Applied Microbiology, 22(4), 721.
23. Hornykiewicz O. (2002), "L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent", Amino acids, 23(1-3), 65-70. 24. Hughes A. B. (2011), Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic
Chemistry, Analysis and Function of Amino Acids and Peptides, Wiley-
VCH.
25. Ingle P. K. (2003), "L-DOPA bearing plants", Natural Product Radiance, 2, 126-133.
26. Kaiser A., Scheer M., Hausermann W., et al. (1976), Process for the
preparation of L-DOPA, The United States Patent and Trademark
Office, US 3969397.
27. Khor S., Hsu A. (2007), "The Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics of Levodopa in the Treatment of Parkinsons Disease", Current Clinical Pharmacology, 2(3), 234-243.
28. Knowles W. S. (2002), "Asymmetric hydrogenations (Nobel lecture)",
Angewandte Chemie International Edition, 41(12), 1998-2007.
29. Knowles W. S. (2001), "Asymmetric hydrogenations", Prix Nobel, 2002, 160-174.
30. Knowles W. S., Sabacky M. J., Vineyard B. D. (1977), L-Dopa process
and intermediates, The Unites States Patent and Trademark Office, US
4005127.
31. Kramer M., Kremer-Muschen S., Wubbolts M. G. (2006), Process for the preparation of L-3, 4-dihydroxyphenylalanine by aerobic
fermentation of a microorganism, The Unites States Patent and
32. Krubiiier A. M. (1973), Preparation of L-dopa, The Unites States Patent and Trademark Office, US 3734952.
33. Lees A. J. (1993), "Dopamine agonists in Parkinson's disease: a look at apomorphine", Fundamental & clinical pharmacology, 7(3-4), 121- 128.
34. LeWitt P. A. (2008), "Levodopa for the treatment of Parkinson's disease", New England Journal of Medicine, 359(23), 2468-2476.
35. O’Neil M. J., Smith A., Heckelman P. E. (2001), "The Merck Index, Merck & Co", Inc., Whitehouse Station, NJ, 25.
36. Ogata Y. Tabuchi H. (1964), "A study on the mechanism of Fries reaction", Tetrahedron,, 20(7), 1661-1666.
37. Ramya K. B., Thaakur S. (2007), "Herbs containing L-Dopa: An update".
38. Reinhold D. F, Utne T., Abramson N. L. (1987), Process for L-dopa, The Unites States Patent and Trademark Office, US 4716246.
39. Semersky F. E. (1974), Stereospecific process for the preparation of L- 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa) and analogs thereof, The Unites States Patent and Trademark Office, US 3812009.
40. Shetty P. Atallah M. T., Shetty K., (2002), "Effects of UV treatment on the proline-linked pentose phosphate pathway for phenolics and L- DOPA synthesis in dark germinated Vicia faba", Process Biochemistry, 37, 1285–1295.
41. Sih C. J., Foss P., Rosazza J., et al. (1969), "Microbiological synthesis of L-3, 4-dihydroxyphenylalanine", Journal of the American Chemical Society, 91(22), 6204-6204.
42. Soltis R. P. (1997), "Pharmacology of antiparkinsonian agents",
43. Standards The Official Compendia of (2013), "United State Pharmacopoeia 34 - NF 34", the edition on CD-rom.
44. The Bristish Pharmacopoeia Commission (2013), Bristish
Pharmacopoeia, the edition on CD-rom.
45. The Bristish Pharmacopoeia Commission (2009), Bristish
Pharmacopoeia, the edition on CD-rom.
46. Wichers H. J., Malingré T. M., Huizing H. J. (1983), "The effect of some environmental factors on the production of L-DOPA by alginate- entrapped cells of Mucuna pruriens", Planta, 158(6), 482-486.
47. Wysong D. V. (1966), Recovery of 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine
from Velvet beans, The Unites States Patent and Trademark Office, US
3253023.
48. Xun L., Lee J. Y. (1998), Method of making L-dopa from L-tyrosine, The Unites States Patent and Trademark Office, US 5837504.
Tiếng Đức
49. Bretschneider H. Hohenlohe-Oehringen K., Kaiser A., Wölcke U., (1973), "Eine neue Synthese des 3-[3,4-Dihydroxy-phenyl]-L-alanins (L-DOPA) aus L-Tyrosin", Helvetica chimica acta, 56(8), 2857-2860. 50. Waser E., Lewandowski M. (1921), "Untersuchungen in der
Phenylalanin-Reihe I. Synthese des l-3, 4-Dihydroxy-phenylalanins",
Helvetica Chimica Acta, 4(1), 657-666.
51. Bretschneider H. Hohenlohe-Oehringen K., Kaiser A., (1970),
Aminosauren und deren derivate, Deutsches patentamt,
PHỤ ỤC Phụ lục 1: Phổ IR của hợp chất 9 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất 10 Phụ lục 3: Phổ IR của hợp chất 11 Phụ lục 4: Phổ IR của hợp chất 1 Phụ lục 5: Phổ MS của hợp chất 10 Phụ lục 6: Phổ MS của hợp chất 11 Phụ lục 7: Phổ MS của hợp chất 1 Phụ lục 8: Phụ lục : Phụ lục 1 : Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của hợp chất 11 Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 11 Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 11 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 Phụ lục 12: Phổ giãn 1H-NMR của hợp chất 1 Phụ lục 13: Phổ IR của levodopa CRS
Phụ lục 14: Phiếu kiểm nghiệm L-dopa
P hụ lụ c 1: Ph ổ IR c ủ a h ợ p ch ấ t 9
P hụ lụ c 2 : Ph ổ IR c ủ a h ợ p ch ấ t 10
P hụ lụ c 3 : Ph ổ IR c ủ