- Tác nhân acyl hóa: Trong phản ứng sử dung tác nhân acyl hóa là anhydrid
acetic. Đây là tác nhân mạnh, phổ biến, có thể acyl hóa đƣợc cả nhóm amin và phenol của L-tyrosin methyl ester.
- Thời gian phản ứng: Trong thời gian đầu (3h đầu), phản ứng diễn ra chậm.
Phản ứng chƣa kết thúc, hiệu suất còn thấp. Sau 4h, phản ứng kết thúc, không còn vết nguyên liệu trên SKLM. Hiệu suất đạt khá cao. Tăng thêm thời gian phản ứng cũng không xảy ra thêm nữa.
- Dung môi tiến hành phản ứng: Trong phản ứng acyl hóa ester 9 tạo diacyl
10, dung môi phản ứng đồng thời đóng vai trò là xúc tác cho phản ứng. Bên cạnh pyridin, với tác nhân acyl hóa là anhydrid acetic có thể dùng các xúc tác
47
là các amin bậc 3 nhƣ triethylamin, quinolin, 4-dimethyl-amino-pyridin hoặc dung dịch kiềm và dung dịch carbonat kiềm [4]. Tuy nhiên, khi sử dụng dung dịch NaOH 2N và dung dịch natri carbonat bão hòa, phản ứng tạo ra sản phẩm phụ. Do vậy, pyridin vẫn là dung môi đƣợc lựa chọn khi tiến hành phản ứng.
- T lệ mol của hai chất tham gia phản ứng: Khi t lệ mol anhydrid acetic: L- tyrosin methyl ester tăng thì hiệu suất phản ứng tăng. Nguyên nhân có thể là do: phản ứng diacyl nên t lệ mol tối thiểu là 2/1, khi tăng t lệ mol lên 2,25/1 thì hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống. Tăng tiếp t lệ này, hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể.
4.1.3. Về phản ứng chu ển vị Fries tạo β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N- acetyl-L-alanin (11)
- Xúc tác: Phản ứng đƣợc xúc tác bởi lƣợng thừa acid Lewis (AlCl3), do có sự hình thành phức với cả nguyên liệu và sản phẩm. Một trong những điều kiện để acid Lewis phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dƣới điều kiện khan nƣớc. Sự hiện diện của một lƣợng nhỏ nƣớc làm ngƣng phản ứng do acid Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức với nƣớc và bị phân hủy. Vì vậy, phản ứng cần đƣợc thực hiện trong dung môi hữu cơ khan nƣớc, dung môi sử dụng là nitrobenzen, xúc tác AlCl3 khan, hóa chất và thiết bị cần đƣợc làm khô trƣớc khi phản ứng [36].
- Vai trò xúc tác của AlCl3 có thể đƣợc mô tả theo cơ chế sau:
48
Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng Fries (nội phân tử)
Cơ chế liên phân tử:
Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng Fries (liên phân tử)
Nhƣ vậy, trong cả 2 cơ chế trên, đều tạo ra phức hợp của nhôm. Theo cơ chế trên, sản phẩm cũng không phải là hợp chất o-acylphenol nhƣ mong đợi, mà là hợp chất phối trí với nhôm clorid. Muốn thu đƣợc sản phẩm, phải cho nƣớc vào để thủy phân hợp chất phối trí để giải phóng sản phẩm. Việc loại phức hợp này ảnh hƣởng lớn đến sự kết tinh của sản phẩm. Chỉ cần lẫn lƣợng nhỏ nhôm chƣa đƣợc loại hết thì sản phẩm không kết tinh đƣợc. Dựa trên đặc
49
tính này, chúng tôi đã thay đổi phƣơng pháp kết tinh để loại hết lƣợng nhôm còn dƣ lẫn trong sản phẩm.
- Dung môi sử dụng: nitrobenzen. Đây là một dung môi khan nƣớc, đóng vai
trò hòa tan xúc tác và diacyl 10. Sự có mặt của dung môi làm tăng khả năng tiếp xúc giữa xúc tác và nguyên liệu, làm tăng khả năng phản ứng. Cũng có thể thay thế dung môi nitrobenzen bằng các dung môi hữu cơ khan nƣớc khác nhƣ: toluen, benzen…Tuy nhiên, các dung môi này đều có độc tính cao, gây ô nhiễm môi trƣờng nên thay thế cũng không có ý nghĩa lớn.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng: Nhiệt độ ảnh hƣởng lớn đến hiệu
suất và thời gian phản ứng. Ở nhiệt độ khoảng 100oC, năng lƣợng chƣa đủ để hình thành sản phẩm chuyển vị ở vị trí ortho do sản phẩm chuyển vị ortho bền hơn nhờ hình thành liên kết hydro nội phân tử, do vậy ở nhiệt độ này, hiệu suất phản ứng thấp. Tăng dần nhiệt độ, phản ứng xảy ra tốt và nhanh hơn. Ở nhiệt độ khoảng 130oC, phản ứng đạt hiệu suất tốt nhất. Tăng tiếp nhiệt độ trên 155oC thì phản ứng bắt đầu phân hủy, bị than hóa đen, làm giảm mạnh hiệu suất phản ứng.
- Sau phản ứng này, tạo ra nhiều chất thải gây độc hại cho môi trƣờng do xúc tác khó thu hồi và phản ứng thực hiện trong dung môi hữu cơ. Do vậy, khi nâng cấp quy trình, cần nghiên cứu với xúc tác và dung môi khác.
4.1.4. Về phản ứng ox h a và thủ phân 11 tạo -dopa
Phản ứng oxy hóa từ 11 đến 12: Lƣợng tác nhân oxy hóa ảnh hƣởng lớn đến thời gian phản ứng oxy hóa và hiệu suất phản ứng. Khi dùng lƣợng lớn tác nhân thì thời gian phản ứng giảm nhanh, hiệu suất phản ứng tăng lên.
Thực chất đây là phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger: Là phản ứng chuyển ceton thành ester. Trong môi trƣờng phản ứng có sự có mặt của dd NaOH, sản phẩm thu đƣợc có thể ở dạng phenol. Cơ chế phản ứng có thể đƣợc biểu diễn theo sơ đồ sau:
50
Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger
Phản ứng thủy phân từ 12 đến 1: Trong các nghiên cứu về phản ứng thủy phân 12 đến 1, các tác giả đều sử dụng tác nhân là HBr 48%. Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân này thì phản ứng xảy ra mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gây ra khó khăn khi tinh chế sản phẩm. Vì vậy chúng tôi đã thay thế HBr bằng hỗn hợp acid với t lệ thể tích HCl đặc: acid acetic băng (1: 2) thì phản ứng xảy ra tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế.
4.1.5. Về phƣơng pháp tinh chế sản phẩm L-dopa
Dựa vào tính chất vật lý, hóa học của L-dopa và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình tinh chế L-dopa đạt hiệu suất cao. Quy trình tinh chế này thực hiện đơn giản, tốn ít thời gian, sử dụng các hóa chất thông thƣờng, ít độc hại và ít gây ô nhiễm môi trƣờng. Áp dụng quy trình tinh chế này, L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo BP 2009. Với quy trình tinh chế này, hoàn toàn có thể áp dụng với các quy mô thí nghiệm lớn hơn. 4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM
4.2.1. Phồ hồng ngoại
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép phân tích đƣợc các dải hấp thụ đặc trƣng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất đƣợc ghi phổ. Do đó, việc phân tích phổ hồng ngoại chủ yếu xác định nhóm chức để thấy đƣợc quá trình phản ứng tạo thành sản phẩm có nhóm chức mong muốn. Ngoài ra, phổ IR
51
đƣợc sử dụng để xác định tính đồng nhất của 2 mẫu chất: chất tổng hợp đƣợc và chất đã biết. Ứng dụng này đặc biệt có ý nghĩa định tính sản phẩm L-dopa.
Trên phổ IR của các chất đƣợc trình bày ở bảng 3.10 đều xuất hiện các dao động hóa trị đặc trƣng cho các nhóm chức có trong công thức của các chất.
- Trên phổ IR của chất trung gian 9 có thấy xuất hiện các dải hấp thụ tƣơng ứng với dao động hóa trị của nhóm -C=O ester (1731 cm-1). Chứng tỏ trong cấu trúc của 9 có nhóm ester và phản ứng ester hoá 2 đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 10 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 1745 cm-1 của nhóm -C=O ester có và đỉnh hấp thụ 1633 cm-1 của nhóm -C=O amid. Chứng tỏ đã xảy ra phản ứng O-acyl hoá và N-acyl hoá hợp chất 9. - Trên phổ IR của hợp chất 11 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 3355 cm-1 thể hiện sự xuất hiện của -OH phenol. Đồng thời xuất hiện dải hấp thụ 1726 cm-1 của nhóm -C=O ceton, đỉnh hấp thụ 1641 cm-1 của nhóm -C=O amid và đỉnh hấp thụ 1599 cm-1 của -COO- (bất đối xứng). Chứng tỏ phân tử chất 11 đã xuất hiện thêm nhóm ceton và -OH phenol so với hợp chất 10 và phản ứng chuyển vị Fries đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 1 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ 3600-3000 cm-1
của nhóm -O-H phenol và -NH3+, đỉnh hấp thụ 1658 cm-1
của nhóm carboxyl và 1570 cm-1 của -NH3
+
(bất đối xứng) có chứng tỏ đã xảy ra phản ứng oxy hoá nhóm ceton tạo -O-H phenol và các nhóm bảo vệ đã đƣợc giải phóng. Ngoài ra, dải hấp thụ khoảng 900-600 cm-1 thể hiện các giá trị thế 3 vị trí 1, 3, 4 của vòng thơm.
4.2.2. Phổ khối lƣợng
Phổ MS dùng để xác định khối lƣợng phân tử của các chất tổng hợp đuợc và số khối các mảnh ion bị phân mảnh từ công thức cấu tạo của các chất.
52
Kết quả phân tích phổ MS trong bảng 3.11 đã cho thấy phổ khối lƣợng của từng chất đều cho các đỉnh cơ bản là các đỉnh có cƣờng độ cao nhất có trị số m/z bằng khối lƣợng phân tử dự kiến của chất cần phân tích.
Đặc biệt tại phổ MS của L-dopa (phụ lục 7): phổ MS phân giải cao đã cho mảnh có m/z phù hợp với khối lƣợng của L-dopa và dự đoán công thức phân tử C9H11NO4 đúng với công thức phân tử của sản phẩm L-dopa (1).
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
Dựa vào phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất. Phổ 1H-NMR xác định sự có mặt của các nhóm có proton dựa vào độ chuyển dịch hóa học, bộ khung của hợp chất (vòng thơm…), số lƣợng proton ở C bên cạnh căn cứ vào độ bội của tín hiệu cộng hƣởng và sự có mặt của tạp chất (các tín hiệu lạ).
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.8, kết quả cho thấy:
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 11, 1 xuất hiện các pic với số lƣợng proton và vị trí proton trong các nhóm phù hợp với công thức cấu tạo các chất.
- Trên cả 2 phổ đều không thấy các tín hiệu lạ, chứng tỏ, các hợp chất 11, 1
đều tinh khiết, không lẫn tạp.
- Phổ 1H-NMR của hợp chất 11 xuất hiện các tín hiệu độ dịch chuyển có giá trị 1,78 ppm của các proton trong nhóm methyl (-NH-CO-CH3), 2,62 ppm của các proton trong nhóm methyl (-CO-CH3), 4,5 ppm của proton trong nhóm -CH- (-CH-COOH), 11,89 của proton phenol, chứng tỏ hợp chất này đã có thêm nhóm -OH, -CO-CH3 gắn với nhân thơm trong phân tử và gốc acid carboxylic.
- Phổ 1H-NMR của L-dopa thấy xuất hiện tín hiệu của 3 proton nhân thơm, chứng tỏ trên nhân thơm có 3 nhóm thế. Cụ thể nhƣ sau δ (ppm): 6,49 (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C6’); 6,57 (1H, d (J=1,5), H-C2’) và 6,65 (1H, d (J=8,0), H- C5’). Trên phổ không thấy xuất hiện các tín hiệu proton trong nhóm methyl (-
53
CO-CH3) so với hợp chất 11, chứng tỏ trên nhân thơm 1 nhóm acetyl đã bị chuyển thành -OH và một nhóm acetyl gắn với -NH bị thủy phân.
- So sánh các giá trị (ppm) của D-dopa [16] và L-dopa trên phổ 1H-NMR thu đƣợc kết quả nhƣ bảng sau:
Bảng 3.17. So sánh kết quả phân tích phổ của D-dopa và L-dopa
L-dopa D-dopa
Công thức cấu tạo
HO HO OH O NH2 1 2 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' Kết quả phổ 1 H-NMR 2,87 (1H, dd (J=14,5; 11,5), Ha-C3) 3,20 (1H, dd (J=14,4; 7,2), Ha-C3) 3,00 (1H, dd (J=14,5; 5,0), Hb-C3) 3,32 (1H, dd (J=14,4; 5,6), Hb-C3) 4,04 (1H, dd (J=7,0; 5,5), H-C2) 4,43 (1H, dd (J=7,2; 5,6), H-C2) 6,49 (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C6') 6,83 (1H, d (J=8,0), H-C6') 6,57 (1H, d (J=1,5), H-C2') 6,93 (1H, s, H-C2') 6,65 (1H, d (J=8,0), H-C5') 6,99 (1H, d (J=8,0), H-C5')
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR cho thấy có sự sai khác giá trị độ dịch chuyển hóa học cùng với hệ số tƣơng tác J của các H của D-dopa so với các H của L-dopa.
Từ các dữ liệu của phổ IR, phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ proton cùng với các giá trị tài liệu tham khảo [16] cho phép đề xuất hợp chất
LD chúng tôi tổng hợp đƣợc là acid (S)-2-amino-3-(3,4-
dihydroxyphenyl)propanoic.
4.3. VỀ CHẤT LƢỢNG NGUYÊN LIỆU L-DOPA TỔNG HỢP ĐƢỢC Nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc đạt yêu cầu chất lƣợng các chỉ tiêu thử: tính chất, định tính, mất khối lƣợng do làm khô và định lƣợng theo BP 2009 trong Phiếu Kiểm nghiệm (Phụ lục 14). Đặc biệt, hàm lƣợng L-dopa
54
trong chế phẩm là 99,4% (nằm trong giới hạn tiêu chuẩn từ 99,0% đến 101,0% , tính theo chế phẩm đã làm khô). Các yêu cầu chất lƣợng đã thử của L-dopa đƣợc quy định trong BP 2009 tƣơng tự trong BP 2013 [44]. Nhƣ vậy, có thể kết luận, nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc đạt yêu cầu chất lƣợng các chỉ tiêu đã thử, đặc biệt là hàm lƣợng theo BP 2013.
55
KẾT UẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã xây dựng đƣợc quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm (hiệu suất toàn bộ quy trình 18,37%) bao gồm 4 giai đoạn:
- Ester hóa L-tyrosin tạo L-tyrosin methyl ester (hiệu suất phản ứng đạt 67,2%).
- Acyl hóa L-tyrosin methyl ester tạo O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester. Đã khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 76,88%.
- Chuyển vị Fries O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester tạo ß-(3-acetyl-4- hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin. Đã khảo sát đƣợc các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 50,7%.
- Oxy hóa ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin tạo N-acetyl- L-dopa và thủy phân nhóm bảo vệ tạo L-dopa. Đã khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của lƣợng dd H2O2 7,1% sử dụng tới hiệu suất phản ứng và hiệu suất phản ứng tốt nhất đạt 86,9%.
Cấu trúc sản phẩm và các dẫn chất trung gian đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp đo phổ: IR, MS, 1
H-NMR.
2. Tổng hợp và tinh chế đƣợc L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009. L-dopa tổng hợp đƣợc có hàm lƣợng 99,4% (nằm trong giới hạn quy định từ 99,0 đến 101,0%, tính theo chế phẩm khan).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu L-dopa tổng hợp đƣợc để nghiên cứu nâng cấp quy trình tổng hợp L-dopa lên quy mô pilot.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Hữu Đĩnh Trần Thị Đà (2009), Ứng dụng một số phương pháp
phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục, 199-317.
2. Nghiêm Thanh Hoàng (2005), Khảo sát một số phương pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng, Khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
3. Lê Thị Luyến (2009), Bệnh học Y học, Nhà xuất bản Y học.
4. Nguyễn Đình Luyện (2009), K thuật hoá dược I, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, 60.
5. Mim.com (2013), Cẩm nang sử dụng thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
6. Hồ Hoàng Nhân (2009), Nghiên cứu cải tiến quy trình thủy phân Keratin và bàn tổng hợp N-acetyl-L-cystein, Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội, pp.
7. Nguyễn Thị Ninh (2008), Nghiên cứu cải tiến quy trình điều chế L-
cystin làm nguyên liệu bán tổng hợp N-acetyl-L-cystein, Khóa luận tốt
nghiệp Dƣợc sĩ, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
8. Nguyễn Đình Triệu (2007), Các phương pháp phổ trong hóa học hữu
cơ và hóa sinh, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
Tiếng Anh
9. Atlas D. (2011), L-DOPA amide derivatives and uses thereof, The United States Patent and Trademark Office, US 8048926 B2.
10. Bennett J. P., Piercey M. F. (1999), "Pramipexole-a new dopamine agonist for the treatment of Parkinson's disease", Journal of the neurological sciences, 163(1), 25-31.
11. Bentué-Ferrer D., Ménard G., Allain H. (1996), "Monoamine Oxidase B inhibitors", CNS drugs, 6(3), 217-236.
12. Bernardi L. Golfredo O. (1973), Process for the preparation of L-dopa,