3.3.3.1. Kết quả phân tích phổ IR
Các phổ đƣợc trình bày ở phụ lục 1, 2, 3, 4. Số liệu phân tích phổ hồng ngoại đƣợc trình bày trong bảng 3.10.
41
Bảng 3.10.Kết quả phân tích phổ IR
Phụ lục Chất Công thức cấu tạo υmax
(cm-1) Nhóm chức 1 9 3208 -NH2 3100-3010 -CHAr 2833 C-H trong (-O-CH3) 1731 -C=O ester 2 10 3256 -NH amid 3100-3010 -CHAr 2937 -C-H (trong hợp chất C-CH3) 1745 -C=O ester 1633 -C=O amid 3 11 3355 -OH phenol 3100-3010 -CHAr 2937 -C-H (trong hợp chất C-CH3) 1726 -C=O ceton 1641 -C=O amid 1599 -COO - (bất đối xứng) 4 1 3600-3000 -OH phenol và – NH3+ 3076 -CHAr 1658 -C=O 1570 -NH3+ (bất đối)
42
3.3.3.2. Kết quả phân tích phổ MS
Kết quả phổ MS đƣợc trình bày tại bảng 3.11:
Bảng 3.11.Kết quả phân tích phổ MS Phụ lục Chất phân tích Công thức phân tử KL phân tử m/z Mảnh 5 10 C14H17NO5 279 301,6 [M+Na]+ 6 11 C13H15NO5 265 263,9 [M-H]- 7 1 C9H11NO4 197 198 [M+H]+ 3.3.3.3. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của 11, 1 đƣợc trình bày nhƣ bảng sau:
Bảng 3.12.Kết quả phân tích phổ 1
H-NMR
Phụ lục Chất phân tích δ ppm)
8
Hợp chất 11
Dung môi đo: Dimethyl sulfoxid (DMSO) 1,78 (3H, s, H3C-CO-NH) 2,62 (3H, s, H3C-CO-Ar) 2,82 (1H, m, Ha-C3) 3,02 (1H, dd (J=13,5; 4,5), Hb-C3) 4,39 (1H, m, H-C-COOH) 6,87 (1H, d (J=7,5), H-C5’) 7,39 (1H, dd (J=8,0; 2,0), H-C6’) 7,75 (1H, d (J=2,0), H-C2’) 8,19 (1H, d (J=8,0), H-N) 11,82 (1H, s, H-O) 9 Hợp chất 1
Dung môi đo: D2O/CF3COOD 2,87 (1H, dd (J=14,5; 11,5), Ha-C3) 3,00 (1H, dd (J=14,5; 5,0), Hb-C3) 4,04 (1H, dd (J=7,0; 5,5), H-C2) 6,49 (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C6’) 6,57 (1H, d (J=1,5), H-C2’) 6,65 (1H, d (J=8,0), H-C5’) 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG L-DOPA THEO CHUYÊN LUẬN DƢỢC ĐIỂN ANH 2009
Sử dụng các phƣơng pháp phân tích, kiểm nghiệm để định tính, định lƣợng LD theo tiêu chuẩn Dƣợc điển Anh 2009.
43
3.4.1. Định tính
- Phƣơng pháp: Đo phổ hồng ngoại của nguyên liệu L-dopa.
- Yêu cầu: Phổ IR của nguyên liệu phải giống với phổ IR của chuẩn Levodopa.
- Kết quả: Đúng
3.4.2. Mất khối lƣợng do làm khô
- Phƣơng pháp: Sấy ở điều kiện thƣờng - Yêu cầu: 1,0%
- Tiến hành: Cân chính xác ~ 0,5 g nguyên liệu, đem sấy ở 100-105oC đến khối lƣợng không đổi.
- Kết quả:
Bảng 3.13. Kết quả xác định hàm ẩm của L-dopa theo phương pháp mất khối lượng do làm khô
T1 T2
Bì (g) 51,6756 49,3625
KL thuốc (g) 0,5004 0,4985
KL Bì + thuốc sau sấy (g) 52,1754 49,8617
Hàm ẩm (X) (%) 0,12 0,14
XTB (%) 0,13 (Đạt)
3.4.3. pH
- Yêu cầu: 4,5-7
- Tiến hành: Khuấy trộn 0,10 g L-dopa với 10ml nƣớc không có CO2 trong 15 phút.
- Kết quả: pH 5 (Đạt).
3.4.4. Định lƣợng
- Phƣơng pháp: Chuẩn độ acid base trong môi trƣờng khan chỉ thị điện thế. - Yêu cầu: 99,0 % -101,0 % (Tính theo chế phẩm khan).
- Tiến hành
44
Yêu cầu: (0,970-1,030); RSD ≤ 0,2%.
Cân chính xác ~ 0,15g kali hydrophtalat (đã đƣợc sấy ở 110o
C trong 4 giờ), hòa tan trong 40,0ml acid acetic băng.
Chuẩn độ bằng dung dịch HClO4 0,1N, chỉ thị điện thế.
Mẫu trắng: 40ml acid acetic băng. K = 02042 , 0 ) (Vt Vtr m
Bảng 3.14. Kết quả xác định hệ số hiệu chỉnh K của dd HClO4 0,1N
mkali hydrophtalat (g) Vt (ml) Vtr (ml) K 0,1524 7,312 0 1,0207 0,1506 7,222 0 1,0212 0,1513 7,265 0 1,0199 0,1532 7,352 0 1,0204 Trung bình 1,0205 RSD % 0,05 Chú thích:
- Vt: Thể tích dd HClO4 cần dùng cho mẫu thử. - Vt: Thể tích dd HClO4 cần dùng cho mẫu trắng. * Định lƣợng:
Cân ≈ 135mg nguyên liệu, hòa tan bằng 5,0ml acid formic khan, thêm 25,0ml acid acetic khan và 25,0ml dioxan.
Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1N (CĐ), chỉ thị điện thế.
Mẫu trắng: Làm tƣơng tự mẫu thử nhƣng không có nguyên liệu 1ml HclO4 0,1N ~ 19,72 mg levodopa. * Kết quả: Công thức: X% ( 0)19,72 100 t T m K V V
45
Bảng 3.15. Kết quả xác định lượng L-dopa
mt (mg) Vt (ml) Vo (ml) X% nguyên trạng X% tính theo khan 136,5 6,750 0,024 99,2 99,3 135,9 6,736 0,024 99,4 99,5 135,7 6,713 0,024 99,2 99,3 Trung Bình RSD % 99,3 99,4 (Đạt) 0,12 Chú thích:
- Vt: Thể tích dd HClO4 cần dùng cho mẫu thử. - Vo: Thể tích dd HClO4 cần dùng cho mẫu trắng. - X%: Hàm lƣợng L-dopa có trong chế phẩm. - mt: Khối lƣợng cân nguyên liệu.
Bảng tóm tắt kết quả định tính, định lƣợng L-dopa theo chuyên luận Dƣợc điển Anh 2009.
Bảng 3.16: Bảng tóm tắt kết quả định tính, định lượng L-dopa theo BP 2009
STT TIÊU CHUẨN YÊU CẦU KẾT QUẢ
1 Định tính Phổ IR: so sánh với phổ IR
của levodopa CRS
Đúng
2 pH 4,5 đến 7,0 Đạt (5)
3 Mất khối lƣợng
do làm khô Tối đa 1,0%
Đạt (0,13%) 4 Định lƣợng Hàm lƣợng l-dopa đạt 99,0 đến 101,0% (tính theo khối lƣợng hợp chất khan) Đạt (99,4%)
46
Chƣơng 4. BÀN UẬN
Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuẩn về định tính và định lƣợng theo BP 2009. Hiệu suất chung của cả quy trình đạt khoảng 18,37%, trong đó phản ứng chuyển vị Fries để tổng hợp
11 có hiệu suất thấp nhất (50,7%). Quá trình phản ứng không có sự racemic hóa. Sau đây là một số bàn luận về quá trình phản ứng và kết quả phân tích phổ của các chất trung gian và sản phẩm L-dopa.
4.1. VỀ CÁC PHẢN ỨNGTỔNG HỢP L-DOPA TỪ L-TYROSIN
4.1.1. Về phản ứng ester h a -t rosin tạo -tyrosin methyl ester
- Phản ứng ester hóa L-tyrosin tạo L-tyrosin methyl ester, tác nhân methanol, xúc tác acid sulfuric đặc là phản ứng thuận nghịch, có hiệu suất khá cao. Với tác nhân ester hóa này, có thể cho hiệu suất đạt trên 90% [20].
- Hiệu suất tinh chế L-tyrosin methyl ester thấp. Nguyên nhân có thể là do dung môi sử dụng để kết tinh là HCl 1N. Trong môi trƣờng acid, ester bị thủy phân ngƣợc trở lại L-tyrosin làm giảm hiệu suất.
4.1.2. Về phản ứng acyl hóa tạo O,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester
- Tác nhân acyl hóa: Trong phản ứng sử dung tác nhân acyl hóa là anhydrid
acetic. Đây là tác nhân mạnh, phổ biến, có thể acyl hóa đƣợc cả nhóm amin và phenol của L-tyrosin methyl ester.
- Thời gian phản ứng: Trong thời gian đầu (3h đầu), phản ứng diễn ra chậm.
Phản ứng chƣa kết thúc, hiệu suất còn thấp. Sau 4h, phản ứng kết thúc, không còn vết nguyên liệu trên SKLM. Hiệu suất đạt khá cao. Tăng thêm thời gian phản ứng cũng không xảy ra thêm nữa.
- Dung môi tiến hành phản ứng: Trong phản ứng acyl hóa ester 9 tạo diacyl
10, dung môi phản ứng đồng thời đóng vai trò là xúc tác cho phản ứng. Bên cạnh pyridin, với tác nhân acyl hóa là anhydrid acetic có thể dùng các xúc tác
47
là các amin bậc 3 nhƣ triethylamin, quinolin, 4-dimethyl-amino-pyridin hoặc dung dịch kiềm và dung dịch carbonat kiềm [4]. Tuy nhiên, khi sử dụng dung dịch NaOH 2N và dung dịch natri carbonat bão hòa, phản ứng tạo ra sản phẩm phụ. Do vậy, pyridin vẫn là dung môi đƣợc lựa chọn khi tiến hành phản ứng.
- T lệ mol của hai chất tham gia phản ứng: Khi t lệ mol anhydrid acetic: L- tyrosin methyl ester tăng thì hiệu suất phản ứng tăng. Nguyên nhân có thể là do: phản ứng diacyl nên t lệ mol tối thiểu là 2/1, khi tăng t lệ mol lên 2,25/1 thì hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống. Tăng tiếp t lệ này, hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể.
4.1.3. Về phản ứng chu ển vị Fries tạo β-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N- acetyl-L-alanin (11)
- Xúc tác: Phản ứng đƣợc xúc tác bởi lƣợng thừa acid Lewis (AlCl3), do có sự hình thành phức với cả nguyên liệu và sản phẩm. Một trong những điều kiện để acid Lewis phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dƣới điều kiện khan nƣớc. Sự hiện diện của một lƣợng nhỏ nƣớc làm ngƣng phản ứng do acid Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức với nƣớc và bị phân hủy. Vì vậy, phản ứng cần đƣợc thực hiện trong dung môi hữu cơ khan nƣớc, dung môi sử dụng là nitrobenzen, xúc tác AlCl3 khan, hóa chất và thiết bị cần đƣợc làm khô trƣớc khi phản ứng [36].
- Vai trò xúc tác của AlCl3 có thể đƣợc mô tả theo cơ chế sau:
48
Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng Fries (nội phân tử)
Cơ chế liên phân tử:
Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng Fries (liên phân tử)
Nhƣ vậy, trong cả 2 cơ chế trên, đều tạo ra phức hợp của nhôm. Theo cơ chế trên, sản phẩm cũng không phải là hợp chất o-acylphenol nhƣ mong đợi, mà là hợp chất phối trí với nhôm clorid. Muốn thu đƣợc sản phẩm, phải cho nƣớc vào để thủy phân hợp chất phối trí để giải phóng sản phẩm. Việc loại phức hợp này ảnh hƣởng lớn đến sự kết tinh của sản phẩm. Chỉ cần lẫn lƣợng nhỏ nhôm chƣa đƣợc loại hết thì sản phẩm không kết tinh đƣợc. Dựa trên đặc
49
tính này, chúng tôi đã thay đổi phƣơng pháp kết tinh để loại hết lƣợng nhôm còn dƣ lẫn trong sản phẩm.
- Dung môi sử dụng: nitrobenzen. Đây là một dung môi khan nƣớc, đóng vai
trò hòa tan xúc tác và diacyl 10. Sự có mặt của dung môi làm tăng khả năng tiếp xúc giữa xúc tác và nguyên liệu, làm tăng khả năng phản ứng. Cũng có thể thay thế dung môi nitrobenzen bằng các dung môi hữu cơ khan nƣớc khác nhƣ: toluen, benzen…Tuy nhiên, các dung môi này đều có độc tính cao, gây ô nhiễm môi trƣờng nên thay thế cũng không có ý nghĩa lớn.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng: Nhiệt độ ảnh hƣởng lớn đến hiệu
suất và thời gian phản ứng. Ở nhiệt độ khoảng 100oC, năng lƣợng chƣa đủ để hình thành sản phẩm chuyển vị ở vị trí ortho do sản phẩm chuyển vị ortho bền hơn nhờ hình thành liên kết hydro nội phân tử, do vậy ở nhiệt độ này, hiệu suất phản ứng thấp. Tăng dần nhiệt độ, phản ứng xảy ra tốt và nhanh hơn. Ở nhiệt độ khoảng 130oC, phản ứng đạt hiệu suất tốt nhất. Tăng tiếp nhiệt độ trên 155oC thì phản ứng bắt đầu phân hủy, bị than hóa đen, làm giảm mạnh hiệu suất phản ứng.
- Sau phản ứng này, tạo ra nhiều chất thải gây độc hại cho môi trƣờng do xúc tác khó thu hồi và phản ứng thực hiện trong dung môi hữu cơ. Do vậy, khi nâng cấp quy trình, cần nghiên cứu với xúc tác và dung môi khác.
4.1.4. Về phản ứng ox h a và thủ phân 11 tạo -dopa
Phản ứng oxy hóa từ 11 đến 12: Lƣợng tác nhân oxy hóa ảnh hƣởng lớn đến thời gian phản ứng oxy hóa và hiệu suất phản ứng. Khi dùng lƣợng lớn tác nhân thì thời gian phản ứng giảm nhanh, hiệu suất phản ứng tăng lên.
Thực chất đây là phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger: Là phản ứng chuyển ceton thành ester. Trong môi trƣờng phản ứng có sự có mặt của dd NaOH, sản phẩm thu đƣợc có thể ở dạng phenol. Cơ chế phản ứng có thể đƣợc biểu diễn theo sơ đồ sau:
50
Sơ đồ 4.3. Cơ chế phản ứng chuyển vị Baeyer-Villiger
Phản ứng thủy phân từ 12 đến 1: Trong các nghiên cứu về phản ứng thủy phân 12 đến 1, các tác giả đều sử dụng tác nhân là HBr 48%. Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân này thì phản ứng xảy ra mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gây ra khó khăn khi tinh chế sản phẩm. Vì vậy chúng tôi đã thay thế HBr bằng hỗn hợp acid với t lệ thể tích HCl đặc: acid acetic băng (1: 2) thì phản ứng xảy ra tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế.
4.1.5. Về phƣơng pháp tinh chế sản phẩm L-dopa
Dựa vào tính chất vật lý, hóa học của L-dopa và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình tinh chế L-dopa đạt hiệu suất cao. Quy trình tinh chế này thực hiện đơn giản, tốn ít thời gian, sử dụng các hóa chất thông thƣờng, ít độc hại và ít gây ô nhiễm môi trƣờng. Áp dụng quy trình tinh chế này, L-dopa đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo BP 2009. Với quy trình tinh chế này, hoàn toàn có thể áp dụng với các quy mô thí nghiệm lớn hơn. 4.2. VỀ CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TRUNG GIAN VÀ SẢN PHẨM
4.2.1. Phồ hồng ngoại
Phân tích phổ hồng ngoại cho phép phân tích đƣợc các dải hấp thụ đặc trƣng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất đƣợc ghi phổ. Do đó, việc phân tích phổ hồng ngoại chủ yếu xác định nhóm chức để thấy đƣợc quá trình phản ứng tạo thành sản phẩm có nhóm chức mong muốn. Ngoài ra, phổ IR
51
đƣợc sử dụng để xác định tính đồng nhất của 2 mẫu chất: chất tổng hợp đƣợc và chất đã biết. Ứng dụng này đặc biệt có ý nghĩa định tính sản phẩm L-dopa.
Trên phổ IR của các chất đƣợc trình bày ở bảng 3.10 đều xuất hiện các dao động hóa trị đặc trƣng cho các nhóm chức có trong công thức của các chất.
- Trên phổ IR của chất trung gian 9 có thấy xuất hiện các dải hấp thụ tƣơng ứng với dao động hóa trị của nhóm -C=O ester (1731 cm-1). Chứng tỏ trong cấu trúc của 9 có nhóm ester và phản ứng ester hoá 2 đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 10 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 1745 cm-1 của nhóm -C=O ester có và đỉnh hấp thụ 1633 cm-1 của nhóm -C=O amid. Chứng tỏ đã xảy ra phản ứng O-acyl hoá và N-acyl hoá hợp chất 9. - Trên phổ IR của hợp chất 11 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ khoảng 3355 cm-1 thể hiện sự xuất hiện của -OH phenol. Đồng thời xuất hiện dải hấp thụ 1726 cm-1 của nhóm -C=O ceton, đỉnh hấp thụ 1641 cm-1 của nhóm -C=O amid và đỉnh hấp thụ 1599 cm-1 của -COO- (bất đối xứng). Chứng tỏ phân tử chất 11 đã xuất hiện thêm nhóm ceton và -OH phenol so với hợp chất 10 và phản ứng chuyển vị Fries đã xảy ra.
- Trên phổ IR của hợp chất 1 đã thấy xuất hiện dải hấp thụ 3600-3000 cm-1
của nhóm -O-H phenol và -NH3+, đỉnh hấp thụ 1658 cm-1
của nhóm carboxyl và 1570 cm-1 của -NH3
+
(bất đối xứng) có chứng tỏ đã xảy ra phản ứng oxy hoá nhóm ceton tạo -O-H phenol và các nhóm bảo vệ đã đƣợc giải phóng. Ngoài ra, dải hấp thụ khoảng 900-600 cm-1 thể hiện các giá trị thế 3 vị trí 1, 3, 4 của vòng thơm.
4.2.2. Phổ khối lƣợng
Phổ MS dùng để xác định khối lƣợng phân tử của các chất tổng hợp đuợc và số khối các mảnh ion bị phân mảnh từ công thức cấu tạo của các chất.
52
Kết quả phân tích phổ MS trong bảng 3.11 đã cho thấy phổ khối lƣợng của từng chất đều cho các đỉnh cơ bản là các đỉnh có cƣờng độ cao nhất có trị số m/z bằng khối lƣợng phân tử dự kiến của chất cần phân tích.
Đặc biệt tại phổ MS của L-dopa (phụ lục 7): phổ MS phân giải cao đã cho mảnh có m/z phù hợp với khối lƣợng của L-dopa và dự đoán công thức phân tử C9H11NO4 đúng với công thức phân tử của sản phẩm L-dopa (1).
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
Dựa vào phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất. Phổ 1H-NMR xác định sự có mặt của các nhóm có proton dựa vào độ chuyển dịch hóa học, bộ khung của hợp chất (vòng thơm…), số lƣợng proton ở C bên cạnh căn cứ vào độ bội của tín hiệu cộng hƣởng và sự có mặt của tạp chất (các tín hiệu lạ).
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR đƣợc trình bày trong bảng 3.8, kết quả cho thấy: