IV. SỰ PHÂT TRIỂN CỦA VI KHUẨN
3. Phương phâp đo độ đục của huyền phù vi khuẩn
*Đo bằng quang phổ kế
Nguyín tắc: Dùng chùm tia sâng đơn sắc chiếu xuyín qua huyền phù chứa vi sinh vật muốn đo, vi sinh vật lăm phđn tân bớt chùm tia sâng nhiều hoặc ít tùy thuộc văo số lượng của chúng trong huyền phù. Số tia sâng còn lại khi xuyín qua huyền phù sẽ kích thích một tế băo quang điện. Tùy theo cường độ còn lại của chùm tia sâng mă tế băo quang điện nhận được,
một cđy kim di động vă chỉ số phần trăm tia sâng bị phđn tân trín bảng chỉ thị (phương phâp năy cho ta biết số lượng vi khuẩn chết vă sống).
Nếu dịch đem đếm không chứa vi sinh vật năo cả thì tất cả ânh sâng xuyín qua vă kích thích tế băo quang điện tối đa, ta điều chỉnh cho kim chỉ ở số 100. Đưa huyền phù cần đo văo. Vì có một số vi sinh vật trong huyền phù nín một số tia sâng bị phđn tân đi. Chỉ còn lại một số ít xuyín qua được, so sânh với bảng chuẩn sẽ biết được mật số trong huyền phù. Chỉ tiến hănh đo độ đục câc mẫu mă ở đó vi sinh vật sinh trưởng lăm đục đồng đều môi trường nuôi cấy, không tạo thănh vâng, khối. Chúng ta có thể âp dụng phương phâp năy đối chiếu với phương phâp đếm trực tiếp để lập một bảng chuẩn cho từng loại vi sinh vật. Ngăy nay trín cơ sở nguyín lý năy người ta chế tạo ra câc loại mây quang phổ kế khâc nhau.
*Dùng mây đếm điện tử: với mây đếm loại năy có thể đếm hăng ngăn tế băo trong vòng văi giđy. Nguyín tắc lă vi sinh vật được đưa qua tia sâng của mắt điện tử, vi sinh vật cản tia sâng vă ghi dấu hiệu trín bộ đếm của mây.
*Sử dụng ống nghiệm có độ đục khâc nhau (dêy ống Macfaland)
Nguyín tắc: dêy ống nghiệm chứa BaSO4 ở câc độ pha loêng khâc nhau tương ứng với độ pha loêng có bảng đối chiếu nồng độ vi khuẩn tương ứng. Đối chiếu độ đục ống nghiệm với dêy ống MacFaland sau đó đối chứng bảng ta sẽ biết đựơc nồng độ vi khuẩn tương ứng.
Câch lăm: dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau. Cho BaCl2 1% văo từng ống theo thứ tự từ một đến 10 (ống 1: 0,1ml ống 2: 0,2ml vă cứ như thế ống 10: 1ml, mỗi ống hơn nhau 0,1 ml).
Sau đó cho văo mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 1% hăn miệng ống nghiệm lại. Lấy ống nghiệm chứa vi khuẩn cần so mău cho văo mây li tđm, gạn rửa, sau đó cho nước sinh lý văo tiếp tục li tđm, gạn rửa 2-3 lần. Cuối cùng cho nước sinh lý văo một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy. Đặt ống nghiệm chứa vi khuẩn đê gạn rửa, văo giữa hai ống MacFacland âng chừng có mău tương tự. Số lượng vi khuẩn có trong một ml dung dịch sẽ nằm trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaclan.
Bảng so mău đânh giâ số lượng vi khuẩn theo MacFaland
Số TT Số vi khuẩn/ml (triệu) Số TT Số vi khuẩn/ml (triệu)
1 300 6 1800
2 600 7 2100
3 900 8 2400
4 1200 9 2700
5 1500 10 3000
4.3. Lý thuyết về sự phât triển của vi khuẩn:
Tế băo vi khuẩn khi được nuôi cấy văo môi trường dinh dưỡng thích hợp, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng vă thể tích, tổng hợp câc thănh phần tế băo cho đến khi kích thước lớn gấp đôi. Vi khuẩn phđn chia cho hai tế băo. Hai tế băo năy, lại tiếp tục sinh trưởng vă phđn chia thănh 4, rồi 8,16 tế băo.
Nếu số tế băo ban đầu không phải lă 1 mă lă N0 thì sau n lần phđn chia ta sẽ có số tế băo tổng cộng lă N:
Câc giâ trị N vă N0 có thể xâc định nhờ phòng đếm hoặc tính số khuẩn lạc mọc trín môi trường đặc. Còn giâ trị n (số thế hệ) có thể tính nhờ logarit thập phđn:
logN = logN0 + n.log2. Từ đó rút ra: n = (2).
Vi dụ: vi khuẩn phđn chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian giữa hai lần phđn chia liín tiếp (hay thời gian cần thiết để vi khuẩn tăng đôi tế băo) gọi lă thời gian thế hệ vă biểu thị bằng g:
g = = (3)
Ở đđy t2-t1 biểu thị sự sai khâc giữa thời gian đầu vă thời gian cuối tính bằng giờ trong đó số tế băo được xâc định. Giâ trị đảo nghịch của thời gian thế hệ hay lă số lần phđn chia sau một đơn vị thời gian (giờ) gọi lă hằng số tốc độ phđn chia C.
C= = = (4)
Rõ răng thời gian thế hệ căng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng vă sinh sản căng nhanh vì: C=n/t nín n=C.t. Thay giâ trị của n văo phương trình (1) ta có:
N = N0 x 2ct
Hằng số tốc độ phđn chia phụ thuộc văo loăi vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy vă môi trường nuôi cấy.
-Loăi vi khuẩn: ví dụ ở 37 0C đối với E. coli C = 3 vă Mycobacterium tuberculosis C=0.07.
-Ảnh hưởng nhiệt độ: ví dụ nuôi cấy vi khuẩn E. coli trong môi trường nước thịt. Tuy nhiín đối với một cơ chất đê cho hằng số tốc độ phđn chia không phụ thuộc văo nồng độ trong một giới hạn rộng. Chẳng hạn khi nuôi cấy Bacilus subtillis trong môi trường chứa glucose dù cho nồng độ 0.3g/lit hay 50g/l ta vẫn có C= 0.8.
-Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy.
Vi khuẩn Môi trường Tốc độ phđn chia
(C) Bacilus subtillis Nước thịt 2 Khoâng -gluco 0.8 Khoâng -citrat 0.3 Khoâng-gluco-citrat 1,2
Nhiệt độ (Oc) (phút)Thời gian thế hệ phđn chiaHằng số tốc độ
18 120 0.5
22 60 1
30 30 2
37 20 3
43 - -
4.4. Biểu đồ phât triển của vi khuẩn
Nếu theo dõi sinh trưởng vă phât triển của vi khuẩn trong điều kiện phòng thí nghiệm, người ta nhận thấy số lượng của chúng tăng lín nhanh chống. Điều năy dễ hiểu vì với điều kiện thích hợp thời gian thế hệ của nhiều loăi vi khuẩn chỉ khoảng 30phút. Rõ răng câc quâ trình sinh tổng hợp cũng như quâ trình dị hoâ, nhằm cung cấp năng lượng, nguyín liệu cho câc phản ứng tổng hợp diễn ra trong tế băo với tốc độ rất nhanh, hoăn toăn không thấy ở câc sinh vật khâc.
Phương phâp nuôi cấy mă trong suốt thời gian đó ta không thím văo đó chất dinh dưỡng cũng không loại bỏ đi câc sản phẩm trao đổi chất cuối cùng gọi lă nuôi cấy tĩnh, sự phât triển của vi khuẩn khi nuôi cấy tĩnh diễn ra qua 4 pha:
*Pha lag: pha năy tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ
sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phđn chia (nghĩa lă chưa có khả năng sinh sản), có thể đđy lă giai đoạn vi sinh vật lăm quen với môi trường nuôi cấy mới vă chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó. Thể tích vă khối lượng tế băo tăng lín rõ rệt do quâ trình tổng hợp câc chất, trước hết lă câc cao phđn tử (protein, enzime, acid nucleic,...) diễn ra mạnh mẽ. Chẳng hạn một số enzime cần cho quâ trình tổng hợp thuộc câc endoenzime loại proteinase, amylase, vă câc enzime nằm trong quâ trình chuyển hóa glucide, đều được hình thănh trong pha năy. Độ dăi của pha năy phụ thuộc văo tuổi của ống giống vă thănh phần của môi truờng. Chẳng hạn pha lag sẽ không có nếu chúng ta dùng ống giống gồm câc tế băo ở pha sinh trưởng logarit vă cấy chúng văo cùng một môi trường dưới những điều kiện nuôi cấy như nhau. Trâi lại nếu ta cấy câc tế băo ở pha ổn định văo một môi trường vă điều kiện nuôi cấy như nhau thì vẫn có pha lag. Thường tế băo giống căng giă thì pha lag căng dăi. Như vậy pha lag phụ thuộc văo những yếu tố sau: tuổi giống, lượng cấy giống vă thănh phần của môi trường.
*Pha logarit: Trong pha năy vi khuẩn sinh trưởng vă phât triển theo luỹ thừa, nghĩa lă sinh khối vă số lượng tế băo tăng theo phương trình: N = N0 x 2ct, kích thước tế băo thănh phần dinh dưỡng, hoạt tính sinh lý, nói chung không thay đổi theo thời gian. Tế băo ở trạng thâi động học vă đuợc coi như lă những tế băo tiíu chuẩn.
*Pha ổn định: trong pha năy quần thể vi khuẩn ở trạng thâi cđn bằng động học, đa số tế băo mới sinh ra bằng số tế băo cũ chết đi. Kết quả cả tế băo vă cả sinh khối không tăng cũng không giảm. Tốc độ sinh trưởng bđy giờ phụ thuộc văo nồng độ cơ chất. Cho nín khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hòan toăn) tôc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Nguyín nhđn tồn tại của pha ổn định lă do sự tích luỹ câc sản phẩm độc của trao đổi chất (rượu acid hữu cơ) vă việc cạn chất dinh duỡng.
*Pha tử vong: trong pha năy số lượng tế băo có khả năng sống giảm theo luỹ thừa (mặc dù số lượng tế băo tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi câc tế băo tự phđn nhờ câc enzyme của bản thđn. ở câc vi khuẩn sinh băo tử thì giai đoạn năy phức tạp hơn do quâ trình hình thănh băo tử.
Ứng dụng biểu đồ phât triển của vi khuẩn văo quâ trình bảo quản vi sinh vật.
+Cấy chuyển thường xuyín trín thạch nghiíng hay cấy trích sđu văo thạch, sau khi đê sinh trưởng vi khuẩn được giữ trong tủ lạnh +40C, phương phâp năy thường dùng nhưng kĩm hiệu quả.
+Bảo quản dưới dầu vô trùng: Dầu parafin vừa ngăn cản môi trường khô vừa ngăn cản trao đổi chất do cản trở sự xđm nhập của oxi.
+Bảo quản trong cât hoặc đất sĩt vô trùng:do cấu trúc lý hoâ của cât đất sĩt rất phù hợp cho việc mang câc vi sinh vật, chủ yếu lă câcbăo tử, sau khi lăm khô đất sĩt, cât cùng với vi khuẩn có thể bảo quản tế băo rất lđu.
+Đông khô: lă phương phâp hòan thiện vă có hiệu quả nhất. Vi khuẩn đuợc trộn với môi trường thích hợp (sữa, huyết thanh,...) rồi lăm lạnh vă lăm khô nhờ băng khô, sau mấy năm bảo quản tế băo vẫn có khả năng sống mă không bị biến đổi về mặt di truyền.
+Bảo quản trong glycerin (10%) vă giữ trong tủ lạnh sđu (-60, -80) đđy lă phương phâp thích hợp.
Sinh trưởng vă phât triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy liín tục
Trong điều kiện nuôi cấy liín tục, kĩo dăi thời gian sinh trưởng, tức lă kĩo dăi pha thứ III. Muốn lăm được như vậy người ta bố trí, hệ thống nuôi cấy gồm một hệ thống bình cấy, phía trín nối với dung dịch nuôi cấy. Phía dưới nối với hệ thống thu sinh khối. Trong bình nuôi cấy có hệ thống sục khí vă que khuấy. Sau một thời gian nuôi cấy người ta rút ra một lượng dung dịch vi khuẩn, sau đó cho văo bình, dịch nuôi cấy vi khuẩn, bằng lượng lấy ra. Như vậy, vi khuẩn sinh sản liín tục, phương phâp năy có thể thu được sinh khối lớn.