Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [13], việc chẩn đoán tương đối khó khăn vì căn bệnh có khi ở mạch máu ngoại vi, có khi không. Do đó phải chẩn đoán tổng hợp, gồm các biện pháp sau:
- Căn cứ vào triệu chứng điển hình: sốt lên xuống, thủy thũng, có triệu
- Dựa vào đặc điểm dịch tễ của bệnh: vùng mắc bệnh, mùa phát bệnh, vật môi giới truyền bệnh.
- Điều trị chẩn đoán: dùng một trong ba loại thuốc đặc hiệu để điều trị chẩn đoán: berenil, trypamidium, nagainin.
2.1.5.1. Chẩn đoán lâm sàng
Nguyễn Thị Kim Lan (2011) [11] cho biết, các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện. Rất nhiều gia súc mang bệnh nhưng khó phát hiện triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính. Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên loạn) và chết nhanh. Trâu bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982) [15]. Triệu chứng sảy thai có thể thấy ở trâu cái ở tháng thứ 7 - 8 tháng bị bệnh tiên mao trùng (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2011) [12].
Nguyễn Đăng Khải (1995) [9], triệu chứng sảy thai có thể thấy ở trâu, bò mắc bệnh tiên mao trùng.
2.1.5.2. Chẩn đoán thí nghiệm
Mục đích của chẩn đoán trong phòng thí nghiệm là phát hiện tiên mao trùng trong máu của gia súc. Tùy từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp
Có thể áp dụng những phương pháp sau: - Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi. Vì vậy, trường hợp này nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt
máu nhỏ lên phiến kính, đậy lamen lên giọt máu để giọt máu dàn theo lamen thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 và 10 x 40) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky),
Đặt một giọt máu tươi cách 1 đầu phiến kính khoảng 2 cm, đặt cạnh của một lamen lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính. Khi máu đã lan hết cạnh lamen, đẩy nhẹ lamen trên phiến kính để dàn máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn methanol trong 2 phút. Nhuộm giemsa trong 25 phút (dung dịch giemsa mẹ pha trong nước cất theo tỷ lệ 1: 9).
Để nghiêng tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ cho trôi hết giemsa thừa, để khô tiêu bản, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100) tìm tiên mao trùng.
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da và tránh hút bằng pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong nhiều tháng (Van Meirvenne N., 1989) [48].
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit: cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị trí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground: cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tương và hồng cầu), dùng pipet lấy một ít huyết tương ở vị trí đó đặt lên phiến kính, đậy
lamen và kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
- Phương pháp tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose - PSG (PSG: Phosphat Saline Glucose) mang điện tích dương đã liên kết và giữ lại các thành phần mang điện tích âm có trong máu là hồng cầu và tiểu cầu. Còn lại, tiên mao trùng được tách ra cùng với dung dịch PSG và huyết tương. Bằng phương pháp này, có thể tách được trên 96% tiên mao trùng.
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Lê Ngọc Mỹ (1994) [21], Đoàn Văn Phúc (1994) [24] cho biết, đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được.
Các phương pháp trên có đặc điểm chung là phát hiện được tiên mao trùng nhưng không triệt để, cho tỷ lệ thấp trên con vật mới nhiễm bệnh dưới một tháng. Chính vì vậy, trong thực tế có nhiều trường hợp không tìm thấy tiên mao trùng trong con vật mới nhiễm do không phải lúc nào tiên mao trùng cũng có ở máu ngoại biên. Do đó, ngày nay người ta thường áp dụng các phương pháp huyết thanh học và sinh học phân tử.
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination Test):
Phạm Sỹ Lăng (1982) [15] cho biết, ngưng kết trên phiến kính giữa kháng nguyên tiên mao trùng sống có sẵn, kiểm tra trên huyết thanh động vật
nghi nhiễm có độ chính xác là 70 - 80%. Theo Đoàn Văn Phúc (1994) [24], Lê Ngọc Vinh (1992) [30], phương pháp được tiến hành như sau: Hoà tan 1 giọt huyết thanh trâu, bò nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao trùng vào, trộn đều, đậy lamen và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40). Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là dương tính và ngược lại là âm tính. Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T.
evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao
trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể. Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface). Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại. Kết quả là các hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt được tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phương pháp này có thể ứng dụng để chẩn đoán nhanh, số lượng nhiều, tỷ lệ phát hiện cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là có thể có phản ứng giả khi pha loãng huyết thanh dương tính ở nồng độ
thấp 1/2, 1/4 và cả ngay khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn tại trong huyết thanh. Mặt khác, phải nhập kháng nguyên của nước ngoài nên giá thành rất cao.
+ Phương pháp ngưng kết trên bản nhựa (CATT - Card Agglutination Test
for Trypanomiasis)
Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên tiên mao trùng đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45 µl). Sau đó cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng que nhựa trộn đều và đánh giá kết quả.
Điểm khác của phương pháp này so với phương pháp LATEX là kháng nguyên dùng cho phản ứng này được nhuộm bằng dung dịch Commassie Blue sau đó đem đông khô. Lương Tố Thu và cs (1996) [27], ứng dụng phương pháp Kit CATT ở Việt Nam để điều tiết bệnh tiên mao trùng, cho biết phương pháp này dễ sử dụng, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Theo tác giả độ nhạy của CATT gần gấp đôi phương pháp tiêm truyền chuột bạch (độ nhạy CATT 73,75%; tiêm truyền chuột bạch 40%).
+ Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect
Fluorescent Antibody Test)
Luckins A. G. và cs (1991) [37], Davidson H. C. và cs (1999) [34], phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực địa. Ngoài việc được dùng làm phản
ứng chuẩn để so sánh với các phương pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT dùng trong nghiên cứu các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể.
Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu, bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu, bò khoẻ mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh. Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu (1994) [26], đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40. Theo Lương Tố Thu và cs (1996) [27], độ nhạy của phương pháp IFAT là 71,25%, trong khi phương pháp tiêm truyền chuột bạch là 40%.
Vương Thị Lan Phương (2004) [25] cho biết, tinh chế kháng nguyên T.
evansi dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán
bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T. evansi phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam, thu được 6 mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (Variable Antigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau.
Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên bề mặt của T. evansi: Đa số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8/26 VAT có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho kháng nguyên khác. Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán. Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay):
được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng globulin (kháng kháng thể) có mang một enzym (Phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó, cho cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo nên màu. So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng.
Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế giới. Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ (2002) [22], đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta.
* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng
+ Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)
Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh. Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng. Theo Lê Ngọc Mỹ (1994) [21], đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Tuy nhiên, phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhậy kém hơn so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển. Vì vậy, phương pháp này không được phổ biến.
+ Phản ứng Suratex: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắn kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm tiên mao trùng. Phản ứng này đang được thử nghiệm và đánh giá ở thực địa.
* Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction)
PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đầy.
Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi polymerase để xác định sự có mặt gen ADN của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh.
Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi phải có trình độ kỹ thuật, trang thiết bị hiện đại nên hiện nay mới đang được thử nghiệm tại một số phòng thí nghiệm hiện đại.