7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.4.2. Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng
khuẩn gây bệnh đường ruột
Chúng tôi cũng kiểm tra khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột là: E.coli, Salmonella typhimurium. Mặc dù chủng vi khuẩn LT31 có khả năng quần tụ song chúng lại không có khả năng đồng quần tụ với các VSV kiểm định. Do vậy sẽ ảnh hƣởng đến khả năng đối kháng của chủng LT31 khi ở trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời và động vật nuôi. Vì vậy, khi sử dụng chủng này để tạo chế phẩm probiotics, cần bổ sung vào chế phẩm chất phụ gia để giúp cho vi khuẩn lactic này có thể tiếp xúc trực tiếp với VSV gây bệnh và tiêu diệt chúng.
36
3.4.3. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic LT31
Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn LT31 đƣợc xác định trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC, nuôi cấy tĩnh. Sau những khoảng thời gian nhất định (0, 1, 2, 4, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 giờ nuôi cấy) dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định một số chỉ tiêu sau:
- Khả năng sinh trƣởng (đo OD620).
- Khả năng sinh axit (đo pH của dịch nuôi cấy và axit tổng số). - Hàm lƣợng glucose (g/l) còn lại trong dịch nuôi cấy.
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.10:
Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 Thời gian (Giờ) OD620 pH Đƣờng sót (g/l) 0 0.256 6.38 20.00 6 1.623 5.29 16.21 12 3.150 4.44 12.75 18 3.496 4.26 9.73 24 4.287 4.18 8.56 30 4.310 4.15 7.01 36 3.428 4.11 6.68 42 3.001 4.09 6.21 48 2.417 4.07 5.93 54 1.980 4.04 5.57 60 1.304 4.01 4.18
37
Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31
Từ đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31(hình 3.10) cho thấy:
Trong 24 giờ đầu, lƣợng đƣờng glucose trong dịch nuôi cấy (là nguồn cung cấp năng lƣợng cho sinh trƣởng của vi khuẩn) đƣợc sử dụng rất nhiều và lƣợng axit tạo ra lớn làm cho pH của dịch nuôi cấy giảm mạnh. Mật độ tế bào tăng từ 0.256 đến 4.287. Hàm lƣợng glucose giảm từ 20.00 g/l xuống 8.56 g/l; pH giảm từ 6.38 xuống 4.18. Nhƣ vậy là: trong 24 giờ đầu, hoạt động trao đổi chất của chủng LT31 diễn ra mạnh mẽ.
Sau 24 giờ, quá trình sinh trƣởng của chủng LT31 bƣớc vào giai đoạn ổn định, sinh khối tế bào tăng chậm và đạt cân bằng.
Sau 48 giờ, sự sinh trƣởng của chủng LT31 có chiều hƣớng giảm, mật độ tế bào giảm dần, pH của dịch nuôi cấy ít biến đổi mặc dù nguồn năng lƣợng vẫn còn nhiều, hàm lƣợng glucose còn lại trong dịch nuôi cấy là 5.93g/l.
3.4.4. Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31
Khả năng sống sót của chủng LT31 tăng theo giá trị pH (Hình 3.11). Trong môi trƣờng càng axit (giá trị pH càng thấp) thì khả năng sống sót của chủng nghiên cứu càng giảm. Ở môi trƣờng có pH 4.0 khả năng sống sót của chủng LT31 là 64.13% sau 3 giờ ủ, nhƣng ở trong môi trƣờng có pH 2.0 sau 3 giờ ủ sức sống của
0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 Đƣờng sót (g/l) OD620, pH
Thời gian (Giờ)
OD pH
38
chủng này giảm xuống còn 5.7%. Chủng LT31 sống đƣợc trong môi trƣờng có pH 1.5 khi ủ trong 1 giờ.
Hình 3.11. Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31
Ở Việt Nam, Phạm Ngọc Lan và Lê Thanh Bình (2003) đã xác định đƣợc hai chủng L. agalis CH123 và L. salavarius CH156 có khả năng sinh trƣởng đƣợc ở môi trƣờng pH 4.0 [10]. Nguyễn Thị Hƣờng (2003) cũng phân lập đƣợc hai chủng vi khuẩn lactic: YHN77 có khả năng sống sót trong pH ≥ 1.5 và YHN99 có khả năng sống sót trong pH ≥ 2.0 [8].
3.4.5. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng vi khuẩn lactic LT31
Khả năng sống sót trong mật lợn đƣợc thử nghiệm trong môi trƣờng MRS có bổ sung 1 – 5% mật lợn. Kết quả thử nghiệm khả năng sống sót của chủng LT31 sau 1 – 3 giờ ủ với mật lợn đƣợc thể hiện ở hình 3.12. Kết quả này cho thấy: chủng LT31 có khả năng sống sót khá cao trong dịch mật lợn. Bổ sung 1% dịch mật lợn vào môi trƣờng nuôi cấy chủng LT31 không gây ảnh hƣởng nhiều đến sinh trƣởng của chủng này, khả năng sống sót trong 1% dịch mật lợn khi ủ trong 3 giờ đạt 61.09%. Khi bổ sung 5% dịch mật lợn trong môi trƣờng MRS, khả năng sống sót của chủng LT31 giảm xuống 2.15% sau khi ủ trong 3 giờ.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% pH 1.5 pH 2 pH 3 pH 4 Khả năng sống sót % 1 giờ 2 giờ 3 giờ
39
Hình 3.12. Khả năng sống sót trong mật lợn của chủng LT31
Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ các kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và Lê Thanh Bình (2003) cũng cho thấy hai chủng vi khuẩn lactic L. agalis
CH123 và L. salivarius CH156 có khả năng sinh trƣởng đƣợc với 40% axit mật [10]. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hƣờng (2005) trên hai chủng vi khuẩn lactic YHN77 và YHN99 cho thấy: bổ sung 2% mật lợn vào môi trƣờng nuôi cấy hai chủng này không làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của chúng mà còn làm tăng sinh trƣởng của chủng YHN77, nhƣng với 5% mật lợn thì sẽ kìm hãm sự sinh trƣởng của cả hai chủng [8].
Đã nghiên cứu được một số đặc tính probiotics của chủng LT31: có khả năng quần tụ bình thường (78 phút), không có khả năng đồng quần tụ với các VSV kiểm định; sống sót được trong môi trường axit có pH ≥ 2.0 và trong môi trường có pH 1.5 khi ủ trong 1 giờ; sinh trưởng khá tốt trong môi trường có chứa 2% mật lợn; tuy nhiên, chủng sinh trưởng kém trong môi trường có bổ sung 5% mật lợn; khả năng sinh trưởng, sinh axit, sử dụng đường của chủng LT31 cao.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
1 giờ 2 giờ 3 giờ
Khả năng sống sót %
1% mật lợn 2% mật lợn 5% mật lợn
40
3.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31 khuẩn lactic LT31
3.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ (20 - 45ºC) đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic LT31 đƣợc trình bày trong hình 3.13:
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng của chủng LT31
Chủng LT31 sinh trƣởng tốt nhất ở nhiệt độ 35ºC và sinh trƣởng kém nhất ở 45ºC. Có thể kết luận, chủng vi khuẩn LT31 có khả năng sinh trƣởng trong dải nhiệt độ môi trƣờng từ 20ºC đến 45ºC, nhƣng sinh trƣởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 - 35ºC và sinh trƣởng yếu nhất ở điều kiện nhiệt độ môi trƣờng là 45ºC.
3.5.2. Ảnh hưởng của pH
Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic LT31 đƣợc kiểm tra trong môi trƣờng MRS dịch thể đã đƣợc điều chỉnh về pH 3,0 - 8,0 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Kết quả trình bày trong hình 3.14:
0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ pH e*106 tế bào Số lƣợng tế bào (triệu) pH
41
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng của chủng LT31
Kết quả trong hình 3.14 cho thấy chủng LT31 có khả năng sinh trƣởng trong khoảng pH rộng, từ 4.5 đến 8.0.
Chủng LT31 sinh trƣởng mạnh nhất trong môi trƣờng trung tính (pH 6.0 – 7.5). Trong điều kiện pH môi trƣờng thuận lợi LT31 có tốc độ sinh trƣởng nhanh và sinh khối thu đƣợc lớn. Mật độ tế bào đạt giá trị cực đại ở pH 6.5 sau 24 giờ nuôi cấy. Ở điều kiện môi trƣờng có pH axit (3.0 –5.5) và môi trƣờng pH kiềm chủng này sinh trƣởng yếu hơn.
3.5.3. Ảnh hưởng của môi trường tự nhiên
Khả năng sinh trƣởng của chủng LT31 trong môi trƣờng tự nhiên thể hiện ở bảng 3.7:
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tự nhiên đến sự sinh trƣởng và phát triển của chủng LT31
Môi trƣờng Bắp cải Rau má Cải ngọt Hành MRS
pH 3.93 ± 0.2 4.24 ± 0.2 4.87 ± 0.1 4.5 ± 0.2 3.01 ± 0.1 OD620 1.151 ± 0.01 0.547 ± 0.01 0.667 ± 0.01 0.551 ± 0.01 4.157± 0.01 Số lƣợng TB (e*106 ) 106.04 81.88 86.68 82.02 226.28 0 50 100 150 200 250 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH đầu e*106 tế bào pH cuối pH cuối Số lƣợng TB (Triệu TB)
42
Kết quả trong bảng 3.7 cho thấy: chủng vi khuẩn lactic LT31 có khả năng sinh trƣởng trong các môi trƣờng tự nhiên đặc biệt là môi trƣờng dịch chiết bắp cải (25%) mặc dù không cao nhƣ trong môi trƣờng bán tổng hợp MRS. Để giảm chi phí cho việc tạo chế phẩm probiotics, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng của dịch chiết bắp cải đối với sự sinh trƣởng của chủng LT31. Chủng LT31 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS có bổ sung dịch chiết bắp cải với tỉ lệ dịch chiết bắp cải/MRS lần lƣợt là 1:0; 7:3; 1:1; 3:7; 0:1. Sự sinh trƣởng của chủng LT31 đƣợc xác định bằng cách đo mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở 35ºC. Kết quả thể hiện ở bảng 3.8:
Bảng 3.8. Khả năng sinh trƣởng của chủng LT31 trong các môi trƣờng MRS có bổ sung dịch chiết bắp cải
Môi trƣờng 100% bắp cải 70% bắp cải 50% bắp cải 30% bắp cải 100% MRS OD620 1.273 ± 0.02 2.762 ± 0.02 2.159 ± 0.01 1.938± 0.02 4.153± 0.01 Số lƣợng TB (e*106 ) 110.92 170.48 146.36 137.52 226.12
Kết quả trong bảng 3.8 cho thấy: chủng LT31 sinh trƣởng mạnh nhất trong môi trƣờng 100% MRS, tuy nhiên môi trƣờng MRS có bổ sung 70% bắp cải cũng đạt kết quả sinh trƣởng khả quan.
Đã xác định được ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của chủng LT31: có khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt độ môi trường 20ºC - 45ºC, pH môi trường 3.0 – 8.0 nhưng sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30ºC – 35ºC, môi trường trung tính pH 6.0 – 7.0; có khả năng sinh trưởng tốt (đạt OD620 = 2.762) khi nuôi trong môi trường MRS có bổ sung 70% dịch chiết bắp cải.
43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
1.1. Đã phân lập đƣợc 61 chủng VK lactic từ 08 mẫu mật và sáp ong thu đƣợc ở một số khu vực phía Bắc.
1.2. Từ 61 chủng VK lactic phân lập từ mật ong và sáp ong, chúng tôi đã sơ tuyển đƣợc 21 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với các VSV kiểm định, tuyển chọn đƣợc chủng LT31 có khả năng đối kháng mạnh nhất.
1.3. Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh học của chủng LT31: là trực khuẩn, không di động, không sinh bào tử, catalase âm tính, sinh khí CO2 từ glucose. 1.4. Đã nghiên cứu đƣợc một số đặc tính probiotics của chủng LT31: có khả năng
quần tụ bình thƣờng (78 phút), không có khả năng đồng quần tụ với các VSV kiểm định; sống sót đƣợc trong môi trƣờng axit có pH ≥ 2.0 và trong môi trƣờng có pH 1.5 khi ủ trong 1 giờ; sinh trƣởng khá tốt trong môi trƣờng có chứa 2% mật lợn; tuy nhiên, chủng sinh trƣởng kém trong môi trƣờng có bổ sung 5% mật lợn; khả năng sinh trƣởng, sinh axit, sử dụng đƣờng của chủng LT31 cao.
1.5. Đã xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến sự sinh trƣởng của chủng LT31: có khả năng sinh trƣởng trong dải nhiệt độ môi trƣờng 20ºC - 45ºC, pH môi trƣờng 3.0 – 8.0 nhƣng sinh trƣởng tối ƣu ở nhiệt độ 30ºC – 35ºC, môi trƣờng trung tính pH 6.0 – 7.0; có khả năng sinh trƣởng tốt (đạt OD620 = 2.762) khi nuôi trong môi trƣờng MRS có bổ sung 70% dịch chiết bắp cải.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu bản chất yếu tố gây ra khả năng đối kháng với các vi sinh vật kiểm định, tìm môi trƣờng tối ƣu cho khả năng sinh trƣởng và khả năng đối kháng với các VSV kiểm định của chủng LT31.
- Có thể sử dụng chủng LT31 để bổ sung vào chế phẩm probiotics, do đó cần định tên chủng, kiểm tra tính an toàn của chủng trƣớc khi nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics nhƣ là những thức ăn bổ sung thay thế kháng sinh trong chăn nuôi.
44
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1]. Lê Thanh Bình (1997), Vi khuẩn lactic và kỹ thuật gen, những vấn đề và triển vọng trong sản xuất thực phẩm, Unesco workshop Hanoi, tr 1-11.
[2]. Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Yoshimi Benno (1999), Tác dụng tăng trọng đối với gia cầm của chế phẩm của chế phẩm vi sinh vật PRO99, Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 139-144.
[3]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 142-175, 375-428.
[4]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợn, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1978), Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học Kĩ thuật, tập 1, tr 12-20.
[5]. Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tập 2, tr 26-42.
[6]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996),Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 133-138.
[7]. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990),Thực hành vi sinh học, Nxb Giáo dục, tr 17-34, 63-74, 80-83.
[8]. Nguyễn Thị Hƣờng (2005), Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic bổ sung vào chế phẩm probiotic cho lợn con, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội.
[9]. Phạm Thị Ngọc Lan (2007), Ảnh hƣởng của hai chủng Lactobacillus có tính chất probiotic lên khu hệ vi khuẩn đƣờng ruột và sự tăng trọng của gà trong điều kiện bình thƣờng và khi chịu stress nhiệt, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, tr 25-39, 45-51.
[10]. Phạm Thị Ngọc Lan, Lê Thanh Bình (2003), Đặc điểm phân loại chủng Lactobacillus CH123 và CH126 phân lập từ ruột gà, Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, tr 101-105.
[11]. Vũ Văn Ngữ, Trịnh Văn Lan (1979), Loạn khuẩn đƣờng ruột và tác dụng điều trị của Colisuptyl, Nxb y học, tr 194 – 195.
45
[12]. Lƣơng Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp Hà Nội , tr 64 -68, 99 – 107, 128 -130, 289 -331.
[13]. Nguyễn Thị Nhƣ Thanh (2001), Vi sinh vật thú ý, Nxb Nông nghiệp, tr 72 – 115.
[14]. Trần Thị Thúy (1999), Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin cao từ thực phẩm giàu protein lên men lactic, Luận án thạc sĩ khoa học sinh học, Đại học Quốc gia – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 14 – 19.
[15]. Trần Quốc Việt (2005), Probiotic và ứng dụng trong chăn nuôi, Tạp chí hiệp hội thức ăn chăn nuôi Việt Nam, số 35, tr 17-20.
Tài liệu tiếng Anh
[16]. Buchta K. (1983), Lactic acid in Biotechnology, Vol. 3, Florida.
[17]. Fuller R. (1989), Probiotic in man and animal, Journal of Applied Bacteriology 66, p. 365-378.
[18]. Fuller R. (1973), Ecologycal studies on the Lactobacillus flora associated with the crop epithelium of the fowl, Journal of Applied Bacterilogy 36, p 131-139. [19]. Munoz M.S. and Medina V.F.(1995), Effect of feeding probiotic on
performance of growing and finishing pigs, Advances in Production Animal 20, No 1, p 239-245.
[20]. Oh Tae – Kwang and Y. Benno (1998), Anew probiotic from pig waste and its effects on pig, Proc.of Intern Conf. on Asian Netw, On Microbial Researches, 487-497 Yogyakarta, Indonesia 23-25th Febr, 1998.
[21]. Patterson. J.A., and Burkholdel K.M. (2003), Application of prebiotic and probiotic in poultry production, Poultry Science 82, p 627 – 631.
[22]. Peter H.A.Sneth, Mair N.S., Sharpe M.E. and Holt J.G. (1986), Berrgey’s manual of systematic bacteriology, Willimas & wilkins 2, p 1043-1081, 1209- 1221.
[23]. Reniero R.,Cocconcelli P., Bottazzi V., and Morelli L. (1992), High frequency of conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation – promoting factor, Journal of Genneral Microbiology 138, p763 – 768.
46
[24]. Takahashi K., Akiba Y. Matsuda Y. and Ishiki (1997), Effect of probiotics on immune responses in broiler chicks under diffirent sanitary conditions or immune activition, Journal of Animal Science and Technology 68, No 6, p 537-544.
[25]. Terdani A. and Terrini M. (1996), Bacillus cereus in diets pigs, Rivista di Suinicoltura 37, No 12, p27-31.
[26]. Zani J.L., Cruz F.W., Santos A.F., Gil T.C. (1998), Effect of probiotics CenBiot on the control of diarrhea and feed efficiency in pigs, Journal of Applied Microbiology 84, No 1, p 68-71. Các trang web [27]. http:// www.mesander.com/probiotic-definition.htm [28]. http:// tailieu.vn/xem-tai-lieu/probiotic-duong-ruot.148875.html [29].http://www.phununet.com/WikiPhununet/ChiTietWiKi.aspx?m=0&StoreID=6 948