7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu
Nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn trong 20ml môi trƣờng MRS dịch thể, ở 30ºC - 37ºC, kị khí qua đêm. Li tâm 8000vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối. Hòa sinh khối trở lại trong 2ml PBS pH 7.
Tiến hành đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có pH 1.5; 2.0; 3.0; 4.0; 6.5 và ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri và nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ ở pH 6.5 qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các pH 1.5 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trưởng với mật lợn
Nuôi cấy vi khuẩn lactic và xử lý sinh khối vi khuẩn tƣơng tự nhƣ thí nghiệm xác định khả năng chịu axit ở trên, mục 2.2.5.6.
Sau khi đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có chứa 1% , 2% và 5% mật
23
lợn ; ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri, nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lac của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ trong pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các môi trƣờng có 1% , 2% và 5% mật lợn đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu
2.2.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ tƣơng ứng từ 20ºC đến 45ºC với khoảng cách phân biệt là 5ºC. Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của độ pH
Chuẩn bị giống cấp 1 tƣơng tự thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ (mục 2.2.6.1) và cấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể đã điều chỉnh pH ban đầu tƣơng ứng từ 3.0 đến 8.0 với khoảng cách phân biệt là 0.5. Nuôi tĩnh ở điều kiện nhiệt độ thích hợp (xác định ở thí nghiệm trên, mục 2.2.6.1). Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của các môi trường tự nhiên
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng tự nhiên pH 6.5 (25%) nhƣ : môi trƣờng đậu tƣơng, bắp cải, cải ngọt, hành củ, rau má, bí ngô...
24
Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp (đã đƣợc xác định ở các thí nghiệm trƣớc, mục 2.2.6.1 và 2.2.6.2). Xác định mức độ sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620 sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh.
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol
Các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 18 giờ nuôi cấy, đem li tâm dịch nuôi cấy trong 30 phút ở 3000 vòng/phút, tách lấy phần sinh khối. Hòa đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 30% vô trùng và giữ ở -20ºC trong các ống eppendorff vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống tốt trong vòng 1 đến 3 năm.
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả
Xử lí thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số chỉ tiêu nhƣ:
Số trung bình cộng:
Sai số đại diện của trung bình cộng:
Trong đó: Xi: giá trị của mỗi lần đo n: số lần thí nghiệm m: sai số
Sử dụng các phần mềm Excel 2010, Word 2010 để thống kê và xử lí kết quả: Hệ số tƣơng quan thu đƣợc khi xây dựng các đồ thị chuẩn về hàm lƣợng đƣờng còn sót lại trong dịch nuôi cấy, xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD ở bƣớc sóng 620nm…
25
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong
Vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi trong tự nhiên: trong thực phẩm lên men cũng nhƣ không lên men, trong nƣớc, trong đất, cả trong cơ thể động thực vật và con ngƣời. Nhƣng do mục đích của đề tài, chúng tôi giới hạn phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong. Kết quả phân lập đƣợc thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4:
Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic
STT Địa điểm Mẫu Số chủng vi khuẩn
lactic phân lập đƣợc
1 Ngọc Thanh- Vĩnh Phúc Tổ ong mật 3 (LT1 – LT3) 2 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong nuôi lấy mật
bảo tồn ở rừng Điện Biên
5 (LT4 – LT8)
3 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong ruồi tự nhiên 5 (LT9 – LT13) 4 Tam Đảo- Vĩnh Phúc Tổ ong mật trên rừng 4 (LT14 – LT17) 5 Xuân Trƣờng- Nam
Định
Tổ ong nuôi 10 (LT18 – LT27)
6 Hải Hậu- Nam Định Tổ ong nuôi 5 (LT28 – LT32) 7 Lƣơng Sơn- Hòa Bình Tổ ong nuôi lấy mật,
nuôi trong thân cây trên rừng
13 (LT33 – LT45)
8 Từ Hồ- Hƣng Yên Tổ ong nuôi lấy mật 16 (LT46 – LT61)
26
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ mật và sáp ong
STT Tên
chủng
Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào pH OD620 Axit
tổng số
Nhuộm Gram
1 LT1 Tròn lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.785 ± 0.01 13.95 G+ 2 LT2 Tròn, xù xì, trắng đục Cầu khuẩn 4.83 ± 0.1 1.370 ± 0.01 16.65 G+ 3 LT3 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 5.63 ± 0.2 0.558 ± 0.01 4.10 G+ 4 LT4 Xù xì, dẹp,trắng đục Cầu khuẩn 6.11 ± 0.2 1.208 ± 0.01 3.75 G+ 5 LT5 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.06 ± 0.2 1.619 ± 0.01 5.35 G+ 6 LT6 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.96 ± 0.1 1.483 ± 0.01 6.20 G+ 7 LT7 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 5.09 ± 0.1 1.726 ± 0.02 9.35 G+ 8 LT8 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.84 ± 0.1 1.289 ± 0.01 14.85 G+ 9 LT9 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 5.43 ± 0.2 0.754 ± 0.01 4.50 G+ 10 LT10 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.74 ± 0.2 1.403 ± 0.01 4.15 G+ 11 LT11 Xù xì, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.3 1.732 ± 0.01 19.8 G+ 12 LT12 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn 5.09 ± 0.2 1.426 ± 0.01 3.70 G+ 13 LT13 Tròn, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 6.21 ± 0.1 0.632 ± 0.01 3.35 G+ 14 LT14 Xù xì, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 5.26 ± 0.1 1.165 ± 0.01 5.90 G+ 15 LT15 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.19 ± 0.1 0.619 ± 0.01 3.75 G+
27
16 LT16 Xù xì, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 5.91 ± 0.1 0.585 ± 0.01 5.60 G+ 17 LT17 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.14 ± 0.2 1.514 ± 0.01 3.75 G+ 18 LT18 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn 6.03 ± 0.2 1.379 ± 0.01 4.15 G+ 19 LT19 Tròn, dẹt, nhăn, trắng đục Trực khuẩn dài 6.38 ± 0.2 0.755 ± 0.01 7.90 G+ 20 LT20 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.1 2.204 ± 0.02 10.35 G+ 21 LT21 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn dài 4.76 ± 0.1 2.760 ± 0.01 13.05 G+ 22 LT22 Tròn, dẹt, vàng nhạt Cầu khuẩn 4.75 ± 0.1 3.043 ± 0.02 9.25 G+ 23 LT23 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.11 ± 0.1 1.757 ± 0.01 7.75 G+ 24 LT24 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.15 ± 0.1 1.283 ± 0.01 4.35 G+ 25 LT25 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.32 ± 0.2 1.588 ± 0.01 4.10 G+ 26 LT26 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 5.33 ± 0.1 2.226 ± 0.02 3.65 G+ 27 LT27 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 3.91 ± 0.1 2.728 ± 0.02 16.2 G+ 28 LT28 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 3.96 ± 0.1 1.808 ± 0.01 17.1 G+ 29 LT29 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.31 ± 0.1 0.441 ± 0.01 4.55 G+ 30 LT30 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.31 ± 0.2 0.707 ± 0.01 6.70 G+ 31 LT31 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 4.21± 0.1 4.106 ± 0.02 8.15 G+ 32 LT32 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 6.17± 0.1 1.311 ± 0.01 4.90 G+ 33 LT33 Xù xì, lồi, vàng Trực khuẩn 6.39 ± 0.1 3.107 ± 0.02 3.70 G+
28
34 LT34 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.85 ± 0.1 1.347 ± 0.02 20.25 G+ 35 LT35 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.86 ± 0.2 1.582 ± 0.01 17.55 G+ 36 LT36 Tròn, dẹt, nhăn, vàng nhạt Trực khuẩn 4.93± 0.2 1.567 ± 0.01 25.65 G+ 37 LT37 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.2 1.637 ± 0.01 26.55 G+ 38 LT38 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 6.04 ± 0.2 0.389 ± 0.01 7.90 G+ 39 LT39 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.94 ± 0.1 1.322 ± 0.02 10.35 G+ 40 LT40 Tròn, dẹt, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.517 ± 0.02 9.45 G+ 41 LT41 Tròn, lồi, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.388 ± 0.02 11.25 G+ 42 LT42 Tròn, dẹt, trắng sữa Trực khuẩn 4.86 ± 0.1 1.653 ± 0.02 13.95 G+ 43 LT43 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.673 ± 0.01 0,2115 G+ 44 LT44 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn, 4.98 ± 0.1 1.615 ± 0.01 17.55 G+ 45 LT45 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.97 ± 0.1 1.673 ± 0.02 21.15 G+ 46 LT46 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 5.12 ± 0.1 1.592 ± 0.01 3.75 G+ 47 LT47 Tròn, nhăn, dẹt, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 5.11 ± 0.2 1.578 ± 0.01 6.50 G+ 48 LT48 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.10 ± 0.1 1.458 ± 0.01 4.15 G+ 49 LT49 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.87 ± 0.1 1.730 ± 0.02 10.35 G+ 50 LT50 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.85 ± 0.2 1.859 ± 0.02 9.45 G+ 51 LT51 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.88 ± 0.1 1.642 ± 0.02 8.55 G+
29
52 LT52 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn dài 4.85 ± 0.1 1.455 ± 0.01 15.3 G+ 53 LT53 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn dài 5.10 ± 0.2 1.566 ± 0.01 7.80 G+ 54 LT54 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.82 ± 0.2 1.397 ± 0.01 18.9 G+ 55 LT55 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.83 ± 0.1 1.493 ± 0.02 13.95 G+ 56 LT56 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.96 ± 0.1 1.785 ± 0.01 19.35 G+ 57 LT57 Tròn, lồi, nhăn, trắng đục Cầu khuẩn 4.91 ± 0.2 1.687 ± 0.01 14.4 G+ 58 LT58 Tròn, dẹt, trơn, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 4.82 ± 0.1 1.452 ± 0.01 18.9 G+ 59 LT59 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 5.10 ± 0.2 1.608 ± 0.02 6.75 G+ 60 LT60 Tròn, dẹt, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.86 ± 0.1 1.472 ± 0.02 21.15 G+ 61 LT61 Tròn, nhăn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.97 ± 0.3 1.688 ± 0.02 14.4 G+
30
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong
(a) (b)
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào (x1000 lần) của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong
(a)Tế bào hình cầu; (b)Tế bào hình que
Đã phân lập được 61 chủng VK lactic từ 08 mẫu mật và sáp ong thu được ở một số khu vực phía Bắc.
3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch. Kết quả thu đƣợc 21 chủng có hoạt tính đối kháng với ít nhất 01 VSV kiểm định (bảng 3.4).
31
Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc với các chủng vi khuẩn kiểm định
STT Chủng Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định, D-d (mm)
E.coli Bacillus subtilis Salmonella typhimurium Lactobacillus plantarium 1 LT3 - 22 - - 2 LT4 - 2 - 7 3 LT5 - 2 - 5 4 LT 10 29 25 - - 5 LT12 22 25 6 - 6 LT13 22 20 - - 7 LT14 22 24 - - 8 LT15 - 12 - 23 9 LT17 - 25 7 - 10 LT24 24 25 - - 11 LT30 - 34 - - 12 LT31 30 23 7 - 13 LT36 - 22 - - 14 LT39 - 32 - - 15 LT41 - 30 - - 16 LT42 - 18 - - 17 LT43 - 26 - - 18 LT46 - 24 - - 19 LT52 - 27 - - 20 LT53 - 28 - - 21 LT55 - 22 - -
32
Bảng 3.4 cho thấy: có 21 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với
Bacillus subtilis, 3 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với Salmonella typhimurium, 3 chủng có khả năng đối kháng với Lactobacillus plantarium và 6 chủng có khả năng đối kháng với E.coli. Trong đó có chủng LT31 cho vòng vô khuẩn với 3 loại vi sinh vật kiểm định (đó là E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium), vì vậy chúng tôi đã chọn chủng LT31 cho những nghiên cứu tiếp theo.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.5. Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong
(a)VSV kiểm định Lactobacillus plantarum; (b) VSV kiểm định Bacillus subtilis;
(c) và (d) VSV kiểm định E. coli
Từ 61 chủng VK lactic phân lập từ mật ong và sáp ong, chúng tôi đã sơ tuyển được 21 chủng VK lactic có khả năng đối kháng với các chủng VSV kiểm định, tuyển chọn được chủng LT31 có khả năng đối kháng mạnh nhất.
33
3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng vi khuẩn lactic LT31 trên môi trƣờng MRS dịch thể hoặc môi trƣờng MRS có thạch trên đĩa Petri, nuôi cấy 24 giờ ở 35ºC. Kết quả đƣợc tóm tắt trong bảng 3.5:
Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT 31
Ghi chú: - không có hoạt tính
+ có hoạt tính
(a) (b)
Hình 3.6. Hình thái tế bào (x1000) (a) và hình thái khuẩn lạc (b)
của chủng LT31
Đặc điểm Chủng vi khuẩn LT 31
Hình thái khuẩn lạc Tròn, lồi, trắng sữa. Bề mặt trơn bóng.
Hình thái tế bào Hình que, ngắn, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp thành chuỗi. Nhuộm Gram Gram +
Khả năng di động - Khả năng sinh bào tử - Hoạt tính catalaza - Sinh khí CO2 từ glucose +
Khả năng quần tụ Trung bình (78 phút) Khả năng đồng quần tụ với
các VSV kiểm định
34
Nhỏ dung dịch H2O2 3% vào sinh khối tế bào của chủng LT31 không thấy có hiện tƣợng sủi bọt, chứng tỏ trong sinh khối của chủng LT31 không có catalase.
(a) (b)
Hình 3.7. Hoạt tính catalase
(a) Bacillus subtilis có hoạt tính catalase ; (b) Chủng LT31 không có hoạt tính catalase
Kiểm tra khả năng sinh khí CO2 của chủng LT31 trong môi trƣờng với nguồn cacbon là glucose cho thấy chủng này có sinh khí CO2 từ glucose (Hình 3.8). Điều này chứng tỏ chủng LT31 là chủng vi khuẩn lên men lactic dị hình.