7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol
Các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 18 giờ nuôi cấy, đem li tâm dịch nuôi cấy trong 30 phút ở 3000 vòng/phút, tách lấy phần sinh khối. Hòa đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 30% vô trùng và giữ ở -20ºC trong các ống eppendorff vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống tốt trong vòng 1 đến 3 năm.
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả
Xử lí thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số chỉ tiêu nhƣ:
Số trung bình cộng:
Sai số đại diện của trung bình cộng:
Trong đó: Xi: giá trị của mỗi lần đo n: số lần thí nghiệm m: sai số
Sử dụng các phần mềm Excel 2010, Word 2010 để thống kê và xử lí kết quả: Hệ số tƣơng quan thu đƣợc khi xây dựng các đồ thị chuẩn về hàm lƣợng đƣờng còn sót lại trong dịch nuôi cấy, xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD ở bƣớc sóng 620nm…
25
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong
Vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi trong tự nhiên: trong thực phẩm lên men cũng nhƣ không lên men, trong nƣớc, trong đất, cả trong cơ thể động thực vật và con ngƣời. Nhƣng do mục đích của đề tài, chúng tôi giới hạn phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong. Kết quả phân lập đƣợc thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4:
Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic
STT Địa điểm Mẫu Số chủng vi khuẩn
lactic phân lập đƣợc
1 Ngọc Thanh- Vĩnh Phúc Tổ ong mật 3 (LT1 – LT3) 2 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong nuôi lấy mật
bảo tồn ở rừng Điện Biên
5 (LT4 – LT8)
3 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong ruồi tự nhiên 5 (LT9 – LT13) 4 Tam Đảo- Vĩnh Phúc Tổ ong mật trên rừng 4 (LT14 – LT17) 5 Xuân Trƣờng- Nam
Định
Tổ ong nuôi 10 (LT18 – LT27)
6 Hải Hậu- Nam Định Tổ ong nuôi 5 (LT28 – LT32) 7 Lƣơng Sơn- Hòa Bình Tổ ong nuôi lấy mật,
nuôi trong thân cây trên rừng
13 (LT33 – LT45)
8 Từ Hồ- Hƣng Yên Tổ ong nuôi lấy mật 16 (LT46 – LT61)
26
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ mật và sáp ong
STT Tên
chủng
Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào pH OD620 Axit
tổng số
Nhuộm Gram
1 LT1 Tròn lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.785 ± 0.01 13.95 G+ 2 LT2 Tròn, xù xì, trắng đục Cầu khuẩn 4.83 ± 0.1 1.370 ± 0.01 16.65 G+ 3 LT3 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 5.63 ± 0.2 0.558 ± 0.01 4.10 G+ 4 LT4 Xù xì, dẹp,trắng đục Cầu khuẩn 6.11 ± 0.2 1.208 ± 0.01 3.75 G+ 5 LT5 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.06 ± 0.2 1.619 ± 0.01 5.35 G+ 6 LT6 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.96 ± 0.1 1.483 ± 0.01 6.20 G+ 7 LT7 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 5.09 ± 0.1 1.726 ± 0.02 9.35 G+ 8 LT8 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.84 ± 0.1 1.289 ± 0.01 14.85 G+ 9 LT9 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 5.43 ± 0.2 0.754 ± 0.01 4.50 G+ 10 LT10 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.74 ± 0.2 1.403 ± 0.01 4.15 G+ 11 LT11 Xù xì, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.3 1.732 ± 0.01 19.8 G+ 12 LT12 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn 5.09 ± 0.2 1.426 ± 0.01 3.70 G+ 13 LT13 Tròn, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 6.21 ± 0.1 0.632 ± 0.01 3.35 G+ 14 LT14 Xù xì, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 5.26 ± 0.1 1.165 ± 0.01 5.90 G+ 15 LT15 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.19 ± 0.1 0.619 ± 0.01 3.75 G+
27
16 LT16 Xù xì, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 5.91 ± 0.1 0.585 ± 0.01 5.60 G+ 17 LT17 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.14 ± 0.2 1.514 ± 0.01 3.75 G+ 18 LT18 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn 6.03 ± 0.2 1.379 ± 0.01 4.15 G+ 19 LT19 Tròn, dẹt, nhăn, trắng đục Trực khuẩn dài 6.38 ± 0.2 0.755 ± 0.01 7.90 G+ 20 LT20 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.1 2.204 ± 0.02 10.35 G+ 21 LT21 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn dài 4.76 ± 0.1 2.760 ± 0.01 13.05 G+ 22 LT22 Tròn, dẹt, vàng nhạt Cầu khuẩn 4.75 ± 0.1 3.043 ± 0.02 9.25 G+ 23 LT23 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.11 ± 0.1 1.757 ± 0.01 7.75 G+ 24 LT24 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.15 ± 0.1 1.283 ± 0.01 4.35 G+ 25 LT25 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.32 ± 0.2 1.588 ± 0.01 4.10 G+ 26 LT26 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 5.33 ± 0.1 2.226 ± 0.02 3.65 G+ 27 LT27 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 3.91 ± 0.1 2.728 ± 0.02 16.2 G+ 28 LT28 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 3.96 ± 0.1 1.808 ± 0.01 17.1 G+ 29 LT29 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.31 ± 0.1 0.441 ± 0.01 4.55 G+ 30 LT30 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.31 ± 0.2 0.707 ± 0.01 6.70 G+ 31 LT31 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 4.21± 0.1 4.106 ± 0.02 8.15 G+ 32 LT32 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 6.17± 0.1 1.311 ± 0.01 4.90 G+ 33 LT33 Xù xì, lồi, vàng Trực khuẩn 6.39 ± 0.1 3.107 ± 0.02 3.70 G+
28
34 LT34 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.85 ± 0.1 1.347 ± 0.02 20.25 G+ 35 LT35 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.86 ± 0.2 1.582 ± 0.01 17.55 G+ 36 LT36 Tròn, dẹt, nhăn, vàng nhạt Trực khuẩn 4.93± 0.2 1.567 ± 0.01 25.65 G+ 37 LT37 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.2 1.637 ± 0.01 26.55 G+ 38 LT38 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 6.04 ± 0.2 0.389 ± 0.01 7.90 G+ 39 LT39 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.94 ± 0.1 1.322 ± 0.02 10.35 G+ 40 LT40 Tròn, dẹt, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.517 ± 0.02 9.45 G+ 41 LT41 Tròn, lồi, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.388 ± 0.02 11.25 G+ 42 LT42 Tròn, dẹt, trắng sữa Trực khuẩn 4.86 ± 0.1 1.653 ± 0.02 13.95 G+ 43 LT43 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.673 ± 0.01 0,2115 G+ 44 LT44 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn, 4.98 ± 0.1 1.615 ± 0.01 17.55 G+ 45 LT45 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.97 ± 0.1 1.673 ± 0.02 21.15 G+ 46 LT46 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 5.12 ± 0.1 1.592 ± 0.01 3.75 G+ 47 LT47 Tròn, nhăn, dẹt, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 5.11 ± 0.2 1.578 ± 0.01 6.50 G+ 48 LT48 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.10 ± 0.1 1.458 ± 0.01 4.15 G+ 49 LT49 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.87 ± 0.1 1.730 ± 0.02 10.35 G+ 50 LT50 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.85 ± 0.2 1.859 ± 0.02 9.45 G+ 51 LT51 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.88 ± 0.1 1.642 ± 0.02 8.55 G+
29
52 LT52 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn dài 4.85 ± 0.1 1.455 ± 0.01 15.3 G+ 53 LT53 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn dài 5.10 ± 0.2 1.566 ± 0.01 7.80 G+ 54 LT54 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.82 ± 0.2 1.397 ± 0.01 18.9 G+ 55 LT55 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.83 ± 0.1 1.493 ± 0.02 13.95 G+ 56 LT56 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.96 ± 0.1 1.785 ± 0.01 19.35 G+ 57 LT57 Tròn, lồi, nhăn, trắng đục Cầu khuẩn 4.91 ± 0.2 1.687 ± 0.01 14.4 G+ 58 LT58 Tròn, dẹt, trơn, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 4.82 ± 0.1 1.452 ± 0.01 18.9 G+ 59 LT59 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 5.10 ± 0.2 1.608 ± 0.02 6.75 G+ 60 LT60 Tròn, dẹt, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.86 ± 0.1 1.472 ± 0.02 21.15 G+ 61 LT61 Tròn, nhăn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.97 ± 0.3 1.688 ± 0.02 14.4 G+
30
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong
(a) (b)
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào (x1000 lần) của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ sáp và mật ong
(a)Tế bào hình cầu; (b)Tế bào hình que
Đã phân lập được 61 chủng VK lactic từ 08 mẫu mật và sáp ong thu được ở một số khu vực phía Bắc.
3.2. Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn
Chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch. Kết quả thu đƣợc 21 chủng có hoạt tính đối kháng với ít nhất 01 VSV kiểm định (bảng 3.4).
31
Bảng 3.4. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc với các chủng vi khuẩn kiểm định
STT Chủng Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định, D-d (mm)
E.coli Bacillus subtilis Salmonella typhimurium Lactobacillus plantarium 1 LT3 - 22 - - 2 LT4 - 2 - 7 3 LT5 - 2 - 5 4 LT 10 29 25 - - 5 LT12 22 25 6 - 6 LT13 22 20 - - 7 LT14 22 24 - - 8 LT15 - 12 - 23 9 LT17 - 25 7 - 10 LT24 24 25 - - 11 LT30 - 34 - - 12 LT31 30 23 7 - 13 LT36 - 22 - - 14 LT39 - 32 - - 15 LT41 - 30 - - 16 LT42 - 18 - - 17 LT43 - 26 - - 18 LT46 - 24 - - 19 LT52 - 27 - - 20 LT53 - 28 - - 21 LT55 - 22 - -
32
Bảng 3.4 cho thấy: có 21 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với
Bacillus subtilis, 3 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với Salmonella typhimurium, 3 chủng có khả năng đối kháng với Lactobacillus plantarium và 6 chủng có khả năng đối kháng với E.coli. Trong đó có chủng LT31 cho vòng vô khuẩn với 3 loại vi sinh vật kiểm định (đó là E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium), vì vậy chúng tôi đã chọn chủng LT31 cho những nghiên cứu tiếp theo.
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.5. Khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mật và sáp ong
(a)VSV kiểm định Lactobacillus plantarum; (b) VSV kiểm định Bacillus subtilis;
(c) và (d) VSV kiểm định E. coli
Từ 61 chủng VK lactic phân lập từ mật ong và sáp ong, chúng tôi đã sơ tuyển được 21 chủng VK lactic có khả năng đối kháng với các chủng VSV kiểm định, tuyển chọn được chủng LT31 có khả năng đối kháng mạnh nhất.
33
3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT31
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng vi khuẩn lactic LT31 trên môi trƣờng MRS dịch thể hoặc môi trƣờng MRS có thạch trên đĩa Petri, nuôi cấy 24 giờ ở 35ºC. Kết quả đƣợc tóm tắt trong bảng 3.5:
Bảng 3.5. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của chủng LT 31
Ghi chú: - không có hoạt tính
+ có hoạt tính
(a) (b)
Hình 3.6. Hình thái tế bào (x1000) (a) và hình thái khuẩn lạc (b)
của chủng LT31
Đặc điểm Chủng vi khuẩn LT 31
Hình thái khuẩn lạc Tròn, lồi, trắng sữa. Bề mặt trơn bóng.
Hình thái tế bào Hình que, ngắn, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp thành chuỗi. Nhuộm Gram Gram +
Khả năng di động - Khả năng sinh bào tử - Hoạt tính catalaza - Sinh khí CO2 từ glucose +
Khả năng quần tụ Trung bình (78 phút) Khả năng đồng quần tụ với
các VSV kiểm định
34
Nhỏ dung dịch H2O2 3% vào sinh khối tế bào của chủng LT31 không thấy có hiện tƣợng sủi bọt, chứng tỏ trong sinh khối của chủng LT31 không có catalase.
(a) (b)
Hình 3.7. Hoạt tính catalase
(a) Bacillus subtilis có hoạt tính catalase ; (b) Chủng LT31 không có hoạt tính catalase
Kiểm tra khả năng sinh khí CO2 của chủng LT31 trong môi trƣờng với nguồn cacbon là glucose cho thấy chủng này có sinh khí CO2 từ glucose (Hình 3.8). Điều này chứng tỏ chủng LT31 là chủng vi khuẩn lên men lactic dị hình.
Hình 3.8. Khả năng sinh khí của chủng LT31
Xác định được một số đặc điểm sinh học của chủng LT31: là trực khuẩn, không di động, không sinh bào tử, catalase âm tính, sinh khí CO2 từ glucose.
35
3.4. Một số đặc tính probiotics của chủng vi khuẩn lactic LT31
3.4.1. Khả năng quần tụ của chủng LT31
Kiểm tra khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic đƣợc tuyển chọn (LT31) theo phƣơng pháp của Reniero và cộng sự (1992) cho thấy chủng này có khả năng quần tụ trung bình (Hình 3.9). Thời gian lắng kết của các tế bào của chủng này là 78 phút.
Kết quả này cho thấy chủng vi khuẩn lactic LT31 là vi khuẩn có đặc tính probiotics, do đó có thể sử dụng chủng này để bổ sung vào chế phẩm probitics.
Hình 3.9. Khả năng quần tụ của chủng LT31
3.4.2. Khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khuẩn gây bệnh đường ruột
Chúng tôi cũng kiểm tra khả năng đồng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic LT31 với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột là: E.coli, Salmonella typhimurium. Mặc dù chủng vi khuẩn LT31 có khả năng quần tụ song chúng lại không có khả năng đồng quần tụ với các VSV kiểm định. Do vậy sẽ ảnh hƣởng đến khả năng đối kháng của chủng LT31 khi ở trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời và động vật nuôi. Vì vậy, khi sử dụng chủng này để tạo chế phẩm probiotics, cần bổ sung vào chế phẩm chất phụ gia để giúp cho vi khuẩn lactic này có thể tiếp xúc trực tiếp với VSV gây bệnh và tiêu diệt chúng.
36
3.4.3. Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic LT31
Động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn LT31 đƣợc xác định trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC, nuôi cấy tĩnh. Sau những khoảng thời gian nhất định (0, 1, 2, 4, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60 giờ nuôi cấy) dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định một số chỉ tiêu sau:
- Khả năng sinh trƣởng (đo OD620).
- Khả năng sinh axit (đo pH của dịch nuôi cấy và axit tổng số). - Hàm lƣợng glucose (g/l) còn lại trong dịch nuôi cấy.
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.10:
Bảng 3.6. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31 Thời gian (Giờ) OD620 pH Đƣờng sót (g/l) 0 0.256 6.38 20.00 6 1.623 5.29 16.21 12 3.150 4.44 12.75 18 3.496 4.26 9.73 24 4.287 4.18 8.56 30 4.310 4.15 7.01 36 3.428 4.11 6.68 42 3.001 4.09 6.21 48 2.417 4.07 5.93 54 1.980 4.04 5.57 60 1.304 4.01 4.18
37
Hình 3.10. Động thái sinh trƣởng của chủng LT31
Từ đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng của chủng vi khuẩn lactic LT31(hình 3.10) cho thấy:
Trong 24 giờ đầu, lƣợng đƣờng glucose trong dịch nuôi cấy (là nguồn cung cấp năng lƣợng cho sinh trƣởng của vi khuẩn) đƣợc sử dụng rất nhiều và lƣợng axit tạo ra lớn làm cho pH của dịch nuôi cấy giảm mạnh. Mật độ tế bào tăng từ 0.256 đến 4.287. Hàm lƣợng glucose giảm từ 20.00 g/l xuống 8.56 g/l; pH giảm từ 6.38 xuống 4.18. Nhƣ vậy là: trong 24 giờ đầu, hoạt động trao đổi chất của chủng LT31 diễn ra mạnh mẽ.
Sau 24 giờ, quá trình sinh trƣởng của chủng LT31 bƣớc vào giai đoạn ổn định, sinh khối tế bào tăng chậm và đạt cân bằng.
Sau 48 giờ, sự sinh trƣởng của chủng LT31 có chiều hƣớng giảm, mật độ tế bào giảm dần, pH của dịch nuôi cấy ít biến đổi mặc dù nguồn năng lƣợng vẫn còn nhiều, hàm lƣợng glucose còn lại trong dịch nuôi cấy là 5.93g/l.
3.4.4. Khả năng sống sót trong pH axit của chủng vi khuẩn lactic LT31
Khả năng sống sót của chủng LT31 tăng theo giá trị pH (Hình 3.11). Trong môi trƣờng càng axit (giá trị pH càng thấp) thì khả năng sống sót của chủng nghiên cứu càng giảm. Ở môi trƣờng có pH 4.0 khả năng sống sót của chủng LT31 là 64.13% sau 3 giờ ủ, nhƣng ở trong môi trƣờng có pH 2.0 sau 3 giờ ủ sức sống của
0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 Đƣờng sót (g/l) OD620, pH
Thời gian (Giờ)
OD pH
38
chủng này giảm xuống còn 5.7%. Chủng LT31 sống đƣợc trong môi trƣờng có pH 1.5 khi ủ trong 1 giờ.
Hình 3.11. Khả năng sống sót trong axit của chủng LT31
Ở Việt Nam, Phạm Ngọc Lan và Lê Thanh Bình (2003) đã xác định đƣợc hai