7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose
Các chủng nghiên cứu đƣợc nuôi trong các ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể, bên trong đặt sẵn ống Durham chứa đầy môi trƣờng MRS dịch thể. Sau 24 giờ nuôi cấy, nếu chủng vi khuẩn lactic có sinh khí CO2 khi phân giải glucose thì khí CO2 sẽ đẩy môi trƣờng trong ống Durham ra và tạo thành một khoảng trống chứa khí.
2.2.5.3. Xác định lượng đường còn lại trong dịch nuôi cấy
Bƣớc 1: Thiết lập đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng glucose chuẩn và giá trị OD540 khi cho dung dịch glucose phản ứng màu với dung dịch DNS.
Chuẩn bị dung dịch DNS: Cân 10g dinitro salysilic (DNS), 10g NaOH hoà tan đều vào 300 ml nƣớc cất. Sau đó bổ sung 0.5mg natrisulphyte, 200g muối natri kalitatrate (KNaC4H4O6.4H2O) và 2g phenol, bổ sung nƣớc đến 1000 ml.
Dựng đƣờng chuẩn glucose:
+ Pha dung dịch glucose 100 mol/ml: cân 0.18g glucose hoà tan vào 10 ml nƣớc.
+ Từ dung dịch 100 mol/ml tiến hành pha các dung dịch có nồng độ chuẩn: 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 mol/ml.
20
Lấy 0.5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ chuẩn khác nhau cho thêm vào 0.75 ml DNS, đun sôi 5 phút rồi làm lạnh bằng nƣớc lạnh và đo OD540 đƣợc các giá trị tƣơng ứng.
Đối chứng: tiến hành tƣơng tự nhƣng thay dung dịch glucose bằng nƣớc cất vô trùng.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, kết quả OD540 là giá trị trung bình cộng của cả 3 lần đo. Đồ thị đƣờng chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose và giá trị OD540 (Hình 2.2) đƣợc thiết lập trên phần mềm MS Excel - 2007
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose trong dung dịch và giá trị OD540
(Chú thích: x là giá trị OD540, y là hàm lượng glucose (g/l) trong dung dịch)
Hệ số tƣơng quan R2
= 0.997 thể hiện tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose chuẩn (g/l) và giá trị OD540 là tƣơng đối chặt chẽ, do đó có thể sử dụng hàm số y = 0.764x + 0.038 để tính giá trị μmol glucose trong 1ml dịch pha loãng.
Bƣớc 2: Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy.
Dịch nuôi cấy của chủng nghiên cứu đƣợc pha loãng từ 100 đến 200 lần bằng nƣớc cất vô trùng, tiến hành nhƣ bƣớc 1 nhƣng thay 0.5 ml dung dịch glucose chuẩn bằng 0.5 ml dịch nuôi cấy pha loãng và đo OD540.
Tính lượng glucose còn trong dịch nuôi cấy :
y = 0,764x + 0,038 R² = 0,997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 µmol/ml OD540
21
Từ giá trị OD540, dựa vào đƣờng chuẩn glucose ta tính đƣợc số μmol glucose có trong 1ml dịch lên men đã pha loãng. Từ số μmol glucose này ta tính đƣợc số gam glucose có trong 1ml dịch lên men đã pha loãng theo công thức:
a = 0,18 x (g/l) (Do nồng độ glucose 1μmol/ml dịch nuôi cấy tƣơng ứng với 0.18 gam glucose trong 1 lit dịch mẫu).
Trong đó: a: lượng đường trong dịch pha loãng x: số μmol glucose trong dịch pha loãng
Lƣợng đƣờng trong dịch nuôi cấy là: G = a
*
Trong đó: G: lượng đường dư trong dịch nuôi cấy N: độ pha loãng của mẫu
2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Reniero và cộng sự (1992)
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc nuôi trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 37ºC trong điều kiện kị khí. Sau 24 giờ nuôi cấy, li tâm dịch nuôi cấy ở 8000 vòng/phút trong 10 phút, tách riêng phần dịch và phần sinh khối.
Phần dịch: đem lọc qua bộ lọc vi khuẩn vô trùng, thu đƣợc dịch lọc vô trùng. Phần sinh khối: đƣợc rửa 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó hòa đều sinh khối trong dung dịch PBS pH 6.0 có bổ sung 10% dịch lọc vô trùng sao cho tổng thể tích đem trộn là 1ml. Để ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 2 giờ. Sự xuất hiện các hạt giống hạt cát dƣới đáy ống nghiệm làm cho dịch trở nên trong suốt [23].
Thời gian dịch lắng trong ≤ 60 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ nhanh.
Thời gian lắng dịch trong > 60 phút và < 120 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ bình thƣờng.
Thời gian lắng dịch trong > 120 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ yếu.
2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp của Kmet và cộng sự (1995) phương pháp của Kmet và cộng sự (1995)
Khả năng đồng quần tụ của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu đƣợc kiểm tra với 2 chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli, Salmonella typhimurium.
22
Vi khuẩn lactic nuôi trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC, trong
điều kiện kị khí. Sau 24 giờ nuôi cấy, li tâm dịch nuôi cấy ở 8000vòng/phút trong 10 phút, tách riêng phần dịch và phần sinh khối. Phần sinh khối đƣợc rửa 1 lần bằng nƣớc cất vô trùng, sau đó hòa đều sinh khối trong dung dịch PBS pH 6.0.
Các chủng vi khuẩn kiểm định đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng MPA dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 24 giờ nuôi cấy, dịch nuôi cấy đƣợc xử lý nhƣ đối với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic, đã nêu trên.
Sau đó, trộn đều chủng vi khuẩn lactic và chủng vi khuẩn kiểm định ở cùng thể tích. Để ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 2 giờ để xác định thời gian đồng quần tụ (tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xác định khả năng quần tự, mục 2.2.5.4).
2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu
Nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn trong 20ml môi trƣờng MRS dịch thể, ở 30ºC - 37ºC, kị khí qua đêm. Li tâm 8000vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối. Hòa sinh khối trở lại trong 2ml PBS pH 7.
Tiến hành đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có pH 1.5; 2.0; 3.0; 4.0; 6.5 và ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri và nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ ở pH 6.5 qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các pH 1.5 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trưởng với mật lợn
Nuôi cấy vi khuẩn lactic và xử lý sinh khối vi khuẩn tƣơng tự nhƣ thí nghiệm xác định khả năng chịu axit ở trên, mục 2.2.5.6.
Sau khi đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có chứa 1% , 2% và 5% mật
23
lợn ; ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri, nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lac của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ trong pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các môi trƣờng có 1% , 2% và 5% mật lợn đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu
2.2.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ tƣơng ứng từ 20ºC đến 45ºC với khoảng cách phân biệt là 5ºC. Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của độ pH
Chuẩn bị giống cấp 1 tƣơng tự thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ (mục 2.2.6.1) và cấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể đã điều chỉnh pH ban đầu tƣơng ứng từ 3.0 đến 8.0 với khoảng cách phân biệt là 0.5. Nuôi tĩnh ở điều kiện nhiệt độ thích hợp (xác định ở thí nghiệm trên, mục 2.2.6.1). Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của các môi trường tự nhiên
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng tự nhiên pH 6.5 (25%) nhƣ : môi trƣờng đậu tƣơng, bắp cải, cải ngọt, hành củ, rau má, bí ngô...
24
Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp (đã đƣợc xác định ở các thí nghiệm trƣớc, mục 2.2.6.1 và 2.2.6.2). Xác định mức độ sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620 sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh.
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol
Các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 18 giờ nuôi cấy, đem li tâm dịch nuôi cấy trong 30 phút ở 3000 vòng/phút, tách lấy phần sinh khối. Hòa đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 30% vô trùng và giữ ở -20ºC trong các ống eppendorff vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống tốt trong vòng 1 đến 3 năm.
2.2.8. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả
Xử lí thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số chỉ tiêu nhƣ:
Số trung bình cộng:
Sai số đại diện của trung bình cộng:
Trong đó: Xi: giá trị của mỗi lần đo n: số lần thí nghiệm m: sai số
Sử dụng các phần mềm Excel 2010, Word 2010 để thống kê và xử lí kết quả: Hệ số tƣơng quan thu đƣợc khi xây dựng các đồ thị chuẩn về hàm lƣợng đƣờng còn sót lại trong dịch nuôi cấy, xây dựng đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD ở bƣớc sóng 620nm…
25
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong
Vi khuẩn lactic có mặt ở nhiều nơi trong tự nhiên: trong thực phẩm lên men cũng nhƣ không lên men, trong nƣớc, trong đất, cả trong cơ thể động thực vật và con ngƣời. Nhƣng do mục đích của đề tài, chúng tôi giới hạn phân lập vi khuẩn lactic từ mật và sáp ong. Kết quả phân lập đƣợc thể hiện trong bảng 3.2, hình 3.3 và hình 3.4:
Bảng 3.2. Các mẫu phân lập vi khuẩn lactic
STT Địa điểm Mẫu Số chủng vi khuẩn
lactic phân lập đƣợc
1 Ngọc Thanh- Vĩnh Phúc Tổ ong mật 3 (LT1 – LT3) 2 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong nuôi lấy mật
bảo tồn ở rừng Điện Biên
5 (LT4 – LT8)
3 Điện Biên- Điện Biên Tổ ong ruồi tự nhiên 5 (LT9 – LT13) 4 Tam Đảo- Vĩnh Phúc Tổ ong mật trên rừng 4 (LT14 – LT17) 5 Xuân Trƣờng- Nam
Định
Tổ ong nuôi 10 (LT18 – LT27)
6 Hải Hậu- Nam Định Tổ ong nuôi 5 (LT28 – LT32) 7 Lƣơng Sơn- Hòa Bình Tổ ong nuôi lấy mật,
nuôi trong thân cây trên rừng
13 (LT33 – LT45)
8 Từ Hồ- Hƣng Yên Tổ ong nuôi lấy mật 16 (LT46 – LT61)
26
Bảng 3.3. Một số đặc điểm sinh học của 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc từ mật và sáp ong
STT Tên
chủng
Đặc điểm khuẩn lạc Hình thái tế bào pH OD620 Axit
tổng số
Nhuộm Gram
1 LT1 Tròn lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.785 ± 0.01 13.95 G+ 2 LT2 Tròn, xù xì, trắng đục Cầu khuẩn 4.83 ± 0.1 1.370 ± 0.01 16.65 G+ 3 LT3 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 5.63 ± 0.2 0.558 ± 0.01 4.10 G+ 4 LT4 Xù xì, dẹp,trắng đục Cầu khuẩn 6.11 ± 0.2 1.208 ± 0.01 3.75 G+ 5 LT5 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.06 ± 0.2 1.619 ± 0.01 5.35 G+ 6 LT6 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.96 ± 0.1 1.483 ± 0.01 6.20 G+ 7 LT7 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 5.09 ± 0.1 1.726 ± 0.02 9.35 G+ 8 LT8 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn 4.84 ± 0.1 1.289 ± 0.01 14.85 G+ 9 LT9 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 5.43 ± 0.2 0.754 ± 0.01 4.50 G+ 10 LT10 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.74 ± 0.2 1.403 ± 0.01 4.15 G+ 11 LT11 Xù xì, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.3 1.732 ± 0.01 19.8 G+ 12 LT12 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn 5.09 ± 0.2 1.426 ± 0.01 3.70 G+ 13 LT13 Tròn, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 6.21 ± 0.1 0.632 ± 0.01 3.35 G+ 14 LT14 Xù xì, lồi, vàng nhạt Cầu khuẩn 5.26 ± 0.1 1.165 ± 0.01 5.90 G+ 15 LT15 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.19 ± 0.1 0.619 ± 0.01 3.75 G+
27
16 LT16 Xù xì, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 5.91 ± 0.1 0.585 ± 0.01 5.60 G+ 17 LT17 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.14 ± 0.2 1.514 ± 0.01 3.75 G+ 18 LT18 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn 6.03 ± 0.2 1.379 ± 0.01 4.15 G+ 19 LT19 Tròn, dẹt, nhăn, trắng đục Trực khuẩn dài 6.38 ± 0.2 0.755 ± 0.01 7.90 G+ 20 LT20 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.1 2.204 ± 0.02 10.35 G+ 21 LT21 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn dài 4.76 ± 0.1 2.760 ± 0.01 13.05 G+ 22 LT22 Tròn, dẹt, vàng nhạt Cầu khuẩn 4.75 ± 0.1 3.043 ± 0.02 9.25 G+ 23 LT23 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 6.11 ± 0.1 1.757 ± 0.01 7.75 G+ 24 LT24 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 5.15 ± 0.1 1.283 ± 0.01 4.35 G+ 25 LT25 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.32 ± 0.2 1.588 ± 0.01 4.10 G+ 26 LT26 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 5.33 ± 0.1 2.226 ± 0.02 3.65 G+ 27 LT27 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 3.91 ± 0.1 2.728 ± 0.02 16.2 G+ 28 LT28 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 3.96 ± 0.1 1.808 ± 0.01 17.1 G+ 29 LT29 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn 6.31 ± 0.1 0.441 ± 0.01 4.55 G+ 30 LT30 Tròn, lồi, trắng đục Trực khuẩn ngắn 6.31 ± 0.2 0.707 ± 0.01 6.70 G+ 31 LT31 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 4.21± 0.1 4.106 ± 0.02 8.15 G+ 32 LT32 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 6.17± 0.1 1.311 ± 0.01 4.90 G+ 33 LT33 Xù xì, lồi, vàng Trực khuẩn 6.39 ± 0.1 3.107 ± 0.02 3.70 G+
28
34 LT34 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.85 ± 0.1 1.347 ± 0.02 20.25 G+ 35 LT35 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.86 ± 0.2 1.582 ± 0.01 17.55 G+ 36 LT36 Tròn, dẹt, nhăn, vàng nhạt Trực khuẩn 4.93± 0.2 1.567 ± 0.01 25.65 G+ 37 LT37 Tròn, dẹt, trắng sữa Cầu khuẩn 4.81 ± 0.2 1.637 ± 0.01 26.55 G+ 38 LT38 Tròn, lồi, vàng nhạt Trực khuẩn ngắn 6.04 ± 0.2 0.389 ± 0.01 7.90 G+ 39 LT39 Tròn, lồi, trắng sữa Cầu khuẩn 4.94 ± 0.1 1.322 ± 0.02 10.35 G+ 40 LT40 Tròn, dẹt, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.517 ± 0.02 9.45 G+ 41 LT41 Tròn, lồi, nhăn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.95 ± 0.1 1.388 ± 0.02 11.25 G+ 42 LT42 Tròn, dẹt, trắng sữa Trực khuẩn 4.86 ± 0.1 1.653 ± 0.02 13.95 G+ 43 LT43 Tròn, lồi, trơn, trắng sữa Cầu khuẩn 4.91 ± 0.1 1.673 ± 0.01 0,2115 G+ 44 LT44 Tròn, lồi, trắng đục Cầu khuẩn, 4.98 ± 0.1 1.615 ± 0.01 17.55 G+ 45 LT45 Tròn, dẹt, trắng đục Cầu khuẩn 4.97 ± 0.1 1.673 ± 0.02 21.15 G+ 46 LT46 Tròn, lồi, trắng sữa Trực khuẩn ngắn 5.12 ± 0.1 1.592 ± 0.01 3.75 G+