7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn
Nguyên tắc
Dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế do vi khuẩn nghiên cứu sinh ra trong khối thạch môi trƣờng nuôi cấy vào môi trƣờng thạch có chứa VSV kiểm định. Khu vực nào nào có chất ức chế khuếch tán đến, nơi đó VSV kiểm định không mọc đƣợc và tạo thành vòng vô khuẩn.
Chuẩn bị VSV nghiên cứu và VSV kiểm định
Cấy các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu từ môi trƣờng MRS thạch nghiêng sang môi trƣờng MRS dịch thể, nuôi tĩnh qua đêm ở 37 . Dùng pipette hút 200
dịch huyền phù vi khuẩn lactic nhỏ lên bề mặt môi trƣờng MRS đặc trong hộp đĩa petri, gạt đều bằng que trang vô trùng. Chuyển các hộp petri này vào tủ ấm 37 , nuôi từ 24 -36 giờ để vi khuẩn lactic mọc phủ kín bề mặt môi trƣờng MRS trong đĩa petri.
Dùng que cấy lấy các chủng vi sinh vật kiểm định từ môi trƣờng MPA thạch nghiêng, hòa vào 100 dung dịch NaCl 0,9% trên bề mặt môi trƣờng MPA đặc trong hộp petri, gạt đều bằng que trang vô trùng.
2.2.2.1. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt khối thạch
Dùng khoan nút chai có đƣờng kính d=10mm khoan các khối thạch môi trƣờng đã mọc các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu rồi đặt các khối thạch lên bề mặt môi trƣờng MPA đặc trong hộp petri đã có gạt sẵn VSV kiểm định.
17
Để các hộp đĩa petri này trong tủ mát 4 - 10 . Sau 12 – 14 giờ chuyển các hộp petri này sang tủ ấm 37 cho VSV kiểm định mọc. Kiểm tra vòng ức chế sau 24 giờ nuôi.
Khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic với các vi sinh vật kiểm định đƣợc đánh giá bằng hiệu số D – d (mm). Trong đó, D là đƣờng kính vòng ức chế, d là đƣờng kính khối thạch (d = 10mm). Hiệu số càng lớn thì khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định càng mạnh và ngƣợc lại [4], [7].
Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ thạch
Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 10mm) khoan các khối thạch trên đĩa petri chứa môi trƣờng đặc MPA đã trang sẵn các VSV kiểm định, nhấc bỏ khối thạch để tạo thành các lỗ có đƣờng kính 1cm. Dùng micropipette nhỏ 100 dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào lỗ thạch (dịch nuôi đã đƣợc loại bỏ tế bào vi khuẩn lactic bằng li tâm và đƣợc chỉnh về pH trung tính bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N).
Để các hộp đĩa petri này trong tủ mát 4 - 10 . Sau 12 – 14 giờ chuyển các hộp petri này sang tủ ấm 37 cho VSV kiểm định mọc. Kiểm tra vòng ức chế sau 24 giờ nuôi [4], [7].
Khả năng đối kháng với các vi sinh vật kiểm định đƣợc đánh giá bằng hiệu số D – d (mm); với D là đƣờng kính vòng ức chế, d là đƣờng kính khối thạch (d = 10mm). Hiệu số càng lớn thì khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật kiểm định càng mạnh và ngƣợc lại.
Lặp lại 3 lần cho mỗi thí nghiệm.
2.2.3. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn
Nhân giống chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu trong môi trƣờng MRS dịch thể, sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở 30°C. Hút 1 ml dịch nuôi vi khuẩn, pha loãng trong nƣớc muối sinh lý đã vô trùng để dạt các độ pha loãng từ 10-1
đến 10-10. Dùng pipette lấy 100 μl mẫu ở các độ pha loãng từ 10-6 đến 10-10 nhỏ lên bề mặt môi trƣờng MRS trong đĩa petri, gạt đều bằng que trang vô trùng. Thí nghiệm lặp lặp 3
18
lần cho mỗi độ pha loãng mẫu. Ủ các đĩa petri trên trong tủ ấm 30°C. Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc (CFU) trên mỗi đĩa petri [4].
Số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic trong 1 ml dịch nuôi đƣợc tính theo phƣơng pháp đếm CFU. Đếm 3 đĩa của mỗi độ pha loãng ở thời điểm 48 giờ và kết quả (a) là trung bình cộng của cả 3 lần đếm:
Trong đó: N: số tế bào vi khuẩn lactic trong 1 ml dịch nuôi a: số CFU trên đĩa thạch MRS có độ pha loãng 10-n . 10-n: độ pha loãng của dịch nuôi vi khuẩn lactic
2.2.4. Xây dựng đồ thị chuẩn về mối tương quan giữa số lượng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy với giá trị OD620
Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic nghiên cứu (nuôi ở 30ºC, trong 48 giờ), pha loãng bằng môi trƣờng MRS dịch thể đến các độ pha loãng khác nhau, tiến hành đo OD620 của các dịch pha loãng. Đồng thời xác định số lƣợng tế bào trong các dịch pha loãng tƣơng ứng (bằng phƣơng pháp 2.2.3). Xây dựng đồ thị chuẩn (Hình 2.1) về mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào với OD620 đo đƣợc, từ đó xác định đƣợc hàm số thể hiện mối tƣơng quan giữa giá trị OD620 và số lƣợng tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy.
Hàm tƣơng quan này là cơ sở để tính toán số lƣợng tế bào vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo dựa vào giá trị OD620.
Hình 2.1. Đồ thị chuẩn mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn/ml dịch nuôi và giá trị OD620 của chủng LT31
y = 3.833x + 5.691 R² = 0.9954 0 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 6 106 tế bào / ml OD620
19
Hình 2.1 thể hiện mối tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào vi khuẩn lactic (chủng LT31 đƣợc tuyển chọn) với giá trị OD 620 trong dịch nuôi tƣơng ứng. Hệ số tƣơng quan R2 = 0.995 thể hiện tƣơng quan giữa số lƣợng tế bào và giá trị OD620 của chủng LT31 tƣơng đối chặt chẽ, do đó có thể sử dụng hàm số y= 3.833x + 5.691 để tính số lƣợng tế bào có trong dịch nuôi cấy dựa vào giá trị OD620 đo đƣợc.
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn
2.2.5.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% vào sinh khối tế bào của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu. Nếu thấy hiện tƣợng sủi bọt thì chứng tỏ trong sinh khối có catalase, nếu không sủi bọt thì chứng tỏ trong sinh khối không có catalase.
2.2.5.2. Phát hiện khả năng sinh khí từ glucose
Các chủng nghiên cứu đƣợc nuôi trong các ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể, bên trong đặt sẵn ống Durham chứa đầy môi trƣờng MRS dịch thể. Sau 24 giờ nuôi cấy, nếu chủng vi khuẩn lactic có sinh khí CO2 khi phân giải glucose thì khí CO2 sẽ đẩy môi trƣờng trong ống Durham ra và tạo thành một khoảng trống chứa khí.
2.2.5.3. Xác định lượng đường còn lại trong dịch nuôi cấy
Bƣớc 1: Thiết lập đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng đƣờng glucose chuẩn và giá trị OD540 khi cho dung dịch glucose phản ứng màu với dung dịch DNS.
Chuẩn bị dung dịch DNS: Cân 10g dinitro salysilic (DNS), 10g NaOH hoà tan đều vào 300 ml nƣớc cất. Sau đó bổ sung 0.5mg natrisulphyte, 200g muối natri kalitatrate (KNaC4H4O6.4H2O) và 2g phenol, bổ sung nƣớc đến 1000 ml.
Dựng đƣờng chuẩn glucose:
+ Pha dung dịch glucose 100 mol/ml: cân 0.18g glucose hoà tan vào 10 ml nƣớc.
+ Từ dung dịch 100 mol/ml tiến hành pha các dung dịch có nồng độ chuẩn: 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 mol/ml.
20
Lấy 0.5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ chuẩn khác nhau cho thêm vào 0.75 ml DNS, đun sôi 5 phút rồi làm lạnh bằng nƣớc lạnh và đo OD540 đƣợc các giá trị tƣơng ứng.
Đối chứng: tiến hành tƣơng tự nhƣng thay dung dịch glucose bằng nƣớc cất vô trùng.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, kết quả OD540 là giá trị trung bình cộng của cả 3 lần đo. Đồ thị đƣờng chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose và giá trị OD540 (Hình 2.2) đƣợc thiết lập trên phần mềm MS Excel - 2007
Hình 2.2. Đồ thị chuẩn về mối tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose trong dung dịch và giá trị OD540
(Chú thích: x là giá trị OD540, y là hàm lượng glucose (g/l) trong dung dịch)
Hệ số tƣơng quan R2
= 0.997 thể hiện tƣơng quan giữa hàm lƣợng glucose chuẩn (g/l) và giá trị OD540 là tƣơng đối chặt chẽ, do đó có thể sử dụng hàm số y = 0.764x + 0.038 để tính giá trị μmol glucose trong 1ml dịch pha loãng.
Bƣớc 2: Xác định lƣợng đƣờng còn lại trong dịch nuôi cấy.
Dịch nuôi cấy của chủng nghiên cứu đƣợc pha loãng từ 100 đến 200 lần bằng nƣớc cất vô trùng, tiến hành nhƣ bƣớc 1 nhƣng thay 0.5 ml dung dịch glucose chuẩn bằng 0.5 ml dịch nuôi cấy pha loãng và đo OD540.
Tính lượng glucose còn trong dịch nuôi cấy :
y = 0,764x + 0,038 R² = 0,997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 µmol/ml OD540
21
Từ giá trị OD540, dựa vào đƣờng chuẩn glucose ta tính đƣợc số μmol glucose có trong 1ml dịch lên men đã pha loãng. Từ số μmol glucose này ta tính đƣợc số gam glucose có trong 1ml dịch lên men đã pha loãng theo công thức:
a = 0,18 x (g/l) (Do nồng độ glucose 1μmol/ml dịch nuôi cấy tƣơng ứng với 0.18 gam glucose trong 1 lit dịch mẫu).
Trong đó: a: lượng đường trong dịch pha loãng x: số μmol glucose trong dịch pha loãng
Lƣợng đƣờng trong dịch nuôi cấy là: G = a
*
Trong đó: G: lượng đường dư trong dịch nuôi cấy N: độ pha loãng của mẫu
2.2.5.4. Xác định khả năng quần tụ của chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp của Reniero và cộng sự (1992)
Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc nuôi trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 37ºC trong điều kiện kị khí. Sau 24 giờ nuôi cấy, li tâm dịch nuôi cấy ở 8000 vòng/phút trong 10 phút, tách riêng phần dịch và phần sinh khối.
Phần dịch: đem lọc qua bộ lọc vi khuẩn vô trùng, thu đƣợc dịch lọc vô trùng. Phần sinh khối: đƣợc rửa 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó hòa đều sinh khối trong dung dịch PBS pH 6.0 có bổ sung 10% dịch lọc vô trùng sao cho tổng thể tích đem trộn là 1ml. Để ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 2 giờ. Sự xuất hiện các hạt giống hạt cát dƣới đáy ống nghiệm làm cho dịch trở nên trong suốt [23].
Thời gian dịch lắng trong ≤ 60 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ nhanh.
Thời gian lắng dịch trong > 60 phút và < 120 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ bình thƣờng.
Thời gian lắng dịch trong > 120 phút, các chủng vi khuẩn lactic có khả năng quần tụ yếu.
2.2.5.5. Kiểm tra khả năng đồng quần tụ với các chủng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp của Kmet và cộng sự (1995) phương pháp của Kmet và cộng sự (1995)
Khả năng đồng quần tụ của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu đƣợc kiểm tra với 2 chủng vi sinh vật kiểm định: Escherichia coli, Salmonella typhimurium.
22
Vi khuẩn lactic nuôi trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC, trong
điều kiện kị khí. Sau 24 giờ nuôi cấy, li tâm dịch nuôi cấy ở 8000vòng/phút trong 10 phút, tách riêng phần dịch và phần sinh khối. Phần sinh khối đƣợc rửa 1 lần bằng nƣớc cất vô trùng, sau đó hòa đều sinh khối trong dung dịch PBS pH 6.0.
Các chủng vi khuẩn kiểm định đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng MPA dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 24 giờ nuôi cấy, dịch nuôi cấy đƣợc xử lý nhƣ đối với dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic, đã nêu trên.
Sau đó, trộn đều chủng vi khuẩn lactic và chủng vi khuẩn kiểm định ở cùng thể tích. Để ở nhiệt độ phòng và quan sát trong 2 giờ để xác định thời gian đồng quần tụ (tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp xác định khả năng quần tự, mục 2.2.5.4).
2.2.5.6. Xác định khả năng chịu axit của chủng nghiên cứu
Nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn trong 20ml môi trƣờng MRS dịch thể, ở 30ºC - 37ºC, kị khí qua đêm. Li tâm 8000vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối. Hòa sinh khối trở lại trong 2ml PBS pH 7.
Tiến hành đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có pH 1.5; 2.0; 3.0; 4.0; 6.5 và ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri và nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ ở pH 6.5 qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các pH 1.5 ; 2.0 ; 3.0 ; 4.0 đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.5.7. Xác định khả năng sinh trưởng với mật lợn
Nuôi cấy vi khuẩn lactic và xử lý sinh khối vi khuẩn tƣơng tự nhƣ thí nghiệm xác định khả năng chịu axit ở trên, mục 2.2.5.6.
Sau khi đo OD620 để xác định số lƣợng tế bào trong 1 ml. Bổ sung 100µl chủng vi khuẩn lactic vào môi trƣờng MRS dịch thể có chứa 1% , 2% và 5% mật
23
lợn ; ủ trong thời gian 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ. Sau đó, các dung dịch môi trƣờng thí nghiệm này đƣợc pha loãng với nƣớc muối sinh lý đến độ pha loãng thích hợp và trải đều trên môi trƣờng MRS thạch trong đĩa petri, nuôi ở 30 - 37ºC. Đếm số lƣợng khuẩn lạc (CFU) mọc trên bề mặt môi trƣờng sau 24 giờ nuôi.
Coi số lƣợng khuẩn lac của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu mọc trên môi trƣờng thạch MRS trong đĩa petri sau khi ủ trong pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ khác nhau là 100%. Số lƣợng khuẩn lạc của chủng nghiên cứu đếm đƣợc sau khi ủ trong các môi trƣờng có 1% , 2% và 5% mật lợn đƣợc so sánh với số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc ở pH 6.5 (không chứa mật lợn) qua các giờ tƣơng ứng (đơn vị là %).
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu
2.2.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ tƣơng ứng từ 20ºC đến 45ºC với khoảng cách phân biệt là 5ºC. Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của độ pH
Chuẩn bị giống cấp 1 tƣơng tự thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ (mục 2.2.6.1) và cấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng MRS dịch thể đã điều chỉnh pH ban đầu tƣơng ứng từ 3.0 đến 8.0 với khoảng cách phân biệt là 0.5. Nuôi tĩnh ở điều kiện nhiệt độ thích hợp (xác định ở thí nghiệm trên, mục 2.2.6.1). Xác định mức độ sinh trƣởng, phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620nm sau 24 giờ nuôi cấy.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của các môi trường tự nhiên
Dùng micropipette lấy 100 μl dịch nhân giống cấp 1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu bổ sung vào các ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng tự nhiên pH 6.5 (25%) nhƣ : môi trƣờng đậu tƣơng, bắp cải, cải ngọt, hành củ, rau má, bí ngô...
24
Nuôi ở các điều kiện nhiệt độ, pH thích hợp (đã đƣợc xác định ở các thí nghiệm trƣớc, mục 2.2.6.1 và 2.2.6.2). Xác định mức độ sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phƣơng pháp đo OD ở bƣớc sóng 620 sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh.
2.2.7. Bảo quản chủng giống vi khuẩn trong dung dịch 30% glycerol
Các chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotics đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MRS dịch thể ở 30ºC - 37ºC. Sau 18 giờ nuôi cấy, đem li tâm dịch nuôi cấy trong 30 phút ở 3000 vòng/phút, tách lấy phần sinh khối. Hòa đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 30% vô trùng và giữ ở -20ºC trong các ống eppendorff vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống tốt trong vòng 1 đến 3 năm.