3.3.3.1. Chiết tách ARN
- Có thể chiết tách ARN bằng bộ kắt hoặc phương pháp chiết tách Trizol. - Các mẫu swab chiết tách bằng kắt, khi sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (có thể sử dụng bộ kắt Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #74106 250 prep).
* Chiết tách bằng Trizol
- Cho 0,75 ml Trizol LS reagent (hoặc 1 ml Trizol reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh phẩm nếu dùng Trizol reagent) vào ống eppendorf 1,5 ml. Lắc ựều và ựể ở nhiệt ựộ phòng 5 phút.
- Thêm 0.2 ml chloroform vào mỗi ống. Lắc mạnh trong 15 giây và ựể ở nhiệt ựộ phòng 5 phút.
- Ly tâm ống ở tốc ựộ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4ồC.
- Chuyển phần dịch trong ở trên (khoảng 500 ộl) sang ống eppendorf mới.
- Thêm 0.5 ml Isopropanol và lắc ựều. để 5-10 phút ở nhiệt ựộ phòng. - Ly tâm ống ở tốc ựộ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4ồC. Bỏ dung dịch trong ống ựi.
Rửa ARN ựóng ở ựáy ống bằng cồn 80%, lắc mạnh và ly tâm với tốc ựộ 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4ồC.
Bỏ dung dịch trong ống và làm khô ARN 10 phút ở nhiệt ựộ phòng. Hoà tan lại với 30 ộl nước cất không có Rnase hoặc nước cất ựã xử lý DEPC. * Chiết tách bằng Phương pháp Qiagen RNeasy
- Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500ộl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. Cho 500ộl Qiagen buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc ựều bằng máy Votex.
- Ly tâm (bằng máy Spindown) ựể dịch bệnh phẩm ựọng trên nắp trôi xuống ựáy ống. Cho 500ộl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Votex. Ly tâm mẫu ựã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ựộ 5000 vòng/phút ở nhiệt ựộ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasy
Qiagen ựã ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tâm trong 15 giây tốc ựộ ≥8000 vòng/phút ở nhiệt ựộ phòng. Kiểm tra dịch mẫu ựã thấm qua cột lọc chưa. Lặp lại bước này cho ựến khi toàn bộ mẫu ựã qua cột lọc. Ngoài ra có thể dùng ống hút
QuiVac ựể hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫu. Phương pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc.
-Bổ sung 700ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥8000 vòng/phút, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc. Cho 500ộl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥8000 vòng/phút, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2 ml vào cột lọc. Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa (khoảng 12.000 vòng/phút), bỏ ống thu mẫu.
- đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ựã ựược ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50 ộl RNase free H2O vào cột lọc. Chú ý không ựược chạm ựầu tip vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng/phút. Bỏ cột lọc RNeasy.
- Bảo quản mẫu ARN thu ựược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR. Nếu làm sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -200C hoặc thấp hơn.
3.3.3.2. Tiến hành phản ứng RT-PCR
- Công thức pha: Công thức này có thể thay ựổi cho phù hợp với từng loại primer và từng loại kắt RT-PCR khác nhau. Dưới ựây quy trình giới thiệu 2 bộ kit.
+ Công thức áp dụng cho kắt RT-PCR 1 bước của hãng Qiagen.
H2O 12 ộl 5X Buffer 5 ộl dNTP 1ộl Enzyme mix 1ộl Primer forward 0,5 ộl Primer reverse 0,5 ộl Mẫu RNA 5 ộl Tổng cộng 25 ộl
+ Công thức áp dụng cho kắt RT-PCR của hãng Invitrogen
H2O 6 ộl
2X Reaction mix 12,5 ộl
RT/plat Taq mix 0,5 ộl
Primer forward 0,5 ộl
Primer reverse 0,5 ộl
Mẫu RNA 5 ộl
Tổng cộng 25 ộl
- Chu trình nhân gen 1) 600C Ờ 1 phút 2) 420C Ờ 10 phút 3) 500C Ờ 30 phút 4) 950C Ờ 15 phút
5) 940C Ờ 30 giây (tách sợi)
6) 500C Ờ 30 giây (gắn Primer) Chu trình 35 - 40 vòng 7) 720C Ờ 1 phút (kéo dài)
8) 720C Ờ 10 phút 9) Giữ ở 40C
Quy trình nhân gien này áp dụng cho primer H5 (F 936 và R 1299) và N1 (F6 và R595), ựối với các cặp primer khác quy trình có thể thay ựổi cho phù hợp.
3.3.3.3. Chạy ựiện di
- Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha trong dung dịch TAE hoặc TBE có Ethidium Bromide (10 ộg/ộl).
- Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100 bp).
- Chú ý khi chạy PCR phải có mẫu ựối chứng dương và ựối chứng âm ựi kèm. Tiến hành ựọc kết quả.